Propiedades funcionales y farmacológicas de receptores Cys-loop aniónicos de Caenorhabditis elegans. búsqueda de nuevos fármacos antihelmínticos

RODRIGUEZ ARAUJO, N.; HERNANDO, G.; CORRADI, J.; BOUZAT, C.

Campeche

Congreso; IX congreso iberoamericano de ciencias farmacéuticas de COIFFA en línea - 2021 y expo póster virtual COIFFA 2021.; 2021

Conferencia Iberoamericana de Facultades de Farmacia (COIFFA); Facultad de Ciencias Químico Biológicas (FCQB); Universidad Autónoma de Campeche (UAC).

INTRODUCCIÓN: Caenorhabditis elegans es un modelo de interés en la industria farmacéutica para realizar ensayos in vivo rápidos y económicos, y en particular para la aplicación de métodos y tecnologías de alto rendimiento en ensayos de detección de compuestos con actividad biológica. C. elegans es, además, un modelo de nematodo parasítico, dado que presenta características morfológicas y bioquímicas propias del filo Nematoda. Posee una organización del sistema nervioso semejante a la de especies parasíticas, y es sensible a la mayoría de las drogas utilizadas en la quimioterapia antihelmíntica. Asimismo, los receptores Cys-loop de nematodos tienen importancia clínica por ser blancos de diversos fármacos antihelmínticos. Los canales iónicos activados por ligandos son proteínas integrales de membrana que acoplan la unión de un neurotransmisor específico a la apertura de un canal iónico, lo que permite el pasaje de iones de un lado a otro de la membrana. Dentro de esta clase de receptores se incluye la superfamilia de receptores Cys-loop integrada por los receptores nicotínicos de acetilcolina (AChRs) y el receptor de 5-hidroxitriptamina tipo 3 (5-HT3), los cuales en vertebrados son exclusivamente permeable a cationes (excitatorios), y por los receptores de ácido g-aminobutírico tipos A (GABAA) y receptores de glicina, los cuales son permeables a aniones (inhibitorios). Estudiamos el receptor MOD-1 de la familia de receptores Cys-loop presente en nematodos. Este receptor es activado por serotonina y es permeable a cloruro, a diferencia del receptor 5-HT3 de mamífero, el cual es permeable a sodio (Ranganathan et al., 2000). MOD-1 es similar a los canales de GABA y de glicina de mamíferos en el sitio de unión de agonistas. Poco se sabe acerca de su función molecular en C. elegans y especies parasíticas. Por sus características especiales y su ausencia en humanos podría actuar como un nuevo blanco antihelmíntico. Nos enfocamos en descifrar aspectos farmacológicos y de relación estructura-función de MOD-1, así como sus diferencias con otros receptores Cys-loop de mamíferos. Desciframos las propiedades farmacológicas de MOD-1 y buscamos moduladores novedosos con potencial actividad antihelmíntica mediante la realización de registros de electrofisiología en células de mamíferos que expresan de forma heteróloga MOD-1, como también ensayos de comportamiento en cepas salvajes y mutantes de MOD-1, donde medimos la actividad locomotora en los gusanos. La elucidación de la farmacología molecular de MOD-1 mejora nuestro conocimiento de la función y la selectividad farmacológica de los receptores Cys-loop y contribuye a determinar su potencial como un nuevo blanco para la terapia antihelmíntica.METODOLOGÍA: -Subclonación de cDNA de MOD-1 en el vector pcDNA 3.1: Para la expresión transitoria de receptores, en primer lugar, los cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) del receptor MOD-1 fue subclonado en el vector pCDNA3.1. Se confirmó mediante secuenciación. -Expresión heteróloga del receptor MOD-1: Para la expresión del receptor utilizamos un sistema de expresión heteróloga transitoria. El conteniendo el cDNA se incorporaron mediante la técnica de transfección por precipitación con fosfato de calcio. Para ello utilizamos cultivos celulares BOSC23, derivadas de las células HEK 293, con un 40-50% de confluencia, se incorporaron una mezcla del cDNA de MOD-1 por placa de Petri de 35mm y un plásmido pRBG4-GFP que codifica una proteína verde fluorescente para permitir la identificación de las células transfectadas cuando son observadas con luz ultravioleta. Luego de 24-72 horas de incubación, se logra la expresión del receptor en la membrana celular y, se pueden realizar los estudios electrofisiológicos (Bouzat et al., 2008). Estudios Electrofisiológicos: Los registros de corrientes macroscópicas se realizan en la configuración whole-cell para lo que se utiliza un sistema de perfusión rápida que permite el cambio de solución en 0,1 ms. Las mediciones de pico de corriente en función de la concentración de la droga permiten realizar curvas dosis-respuesta y determinar el EC50, y la medición de la constante de decaimiento permite estimar la velocidad de desensibilización (Rodriguez Araujo et al., 2020). La metodología y estrategias de manipulación de C. elegans se realizan de acuerdo con los protocolos disponibles en Wormbook (Stiernagle 2006). -Ensayos de motilidad de C. elegans: el testeo de drogas lo realizamos utilizando un lector automatizado de motilidad infrarroja, WMicrotracker. Se recolectaron nematodos sincronizados en estadio adultos jóvenes. Por pocillo se colocaron aproximadamente 50 nematodos. Se dejaron estabilizar 30 minutos y el movimiento basal se midió durante 30 minutos para normalizar la actividad de movimiento del 100% para cada pocillo al comienzo del ensayo. Luego, las drogas o el agua (en el caso de los controles), se agregaron a un volumen final de 100 ml por pocillo. Se cuantificó la motilidad en cada condición durante la incubación. RESULTADOS: CARACTERIZAÍÓN ELECTROFISIOLÓGICA DEL RECEPTOR MOD-1: Los registros electrofisiológicos en la configuración de célula entera mostraron que MOD-1 se desensibiliza lentamente y se recupera de la desensibilización con una constante de tiempo de aproximadamente 1 s. En comparación con el receptor 5-HT3A de vertebrados, las curvas de dosis-respuesta fueron similares para la 5-HT pero muy diferentes para los agonistas ortostéricos triptamina y 2-Me-5HT. EFECTOS FARMACOLÓGICOS DE DROGAS ANTIHELMÍNTICAS SOBRE EL RECEPTOR MOD-1: Los antihelmínticos ivermectina (IVM), levamisol y piperazina (PZE), que son agonistas de otros receptores Cys-loop, no activaron MOD-1. Sin embargo, IVM produjo una inhibición leve e irreversible y PZE produjo una inhibición profunda y reversible de las corrientes de MOD-1 provocadas por 5-HT. El análisis indicó que la PZE es un antagonista no competitivo de MOD-1, revelando una función novedosa de este fármaco. ENSAYOS DE COMPORTAMIENTO EN C. elegans: la 5-HT produce una parálisis rápida y reversible de los gusanos de tipo salvaje (WT) mientras que los mutantes MOD-1 son parcialmente resistentes en condiciones similares, lo que indica que MOD-1 es el principal blanco de la 5-HT en este tipo de ensayos. Realizamos ensayos adicionales utilizando combinaciones de fármacos tanto para la cepa WT como para la cepa mutante, los mismos confirmaron la inhibición de la actividad de MOD-1 por la IVM y la PZE. CONCLUSIONES: Identificamos corrientes macroscópicas activadas por la serotonina y caracterizamos el receptor MOD-1 expresado en células BOSC23, para ser utilizado como un nuevo blanco de fármacos antiparasitarios, y revelamos diferencias en la selectividad de fármacos entre receptores Cys-loop de vertebrados y MOD-1 de nematodos. La inhibición de la piperazina de las corrientes de 5-HT por preincubación y no co-aplicación con el agonista sugiere fuertemente que la piperazina es un antagonista no competitivo de MOD-1, revelando así un nuevo blanco farmacológico para este agente antiparasitario. La caracterización de la activación de MOD-1 y la identificación de nuevos compuestos moduladores contribuyen a la comprensión de su papel en los gusanos, así como al desarrollo de nuevos fármacos antihelmínticos. Los ensayos de comportamiento de C. elegans validan los resultados obtenidos en los estudios electrofisiológicos, demostrando ser MOD-1 uno de los blancos terapéuticos de las drogas testeadas. La elucidación de la farmacología molecular de MOD-1 mejora nuestro conocimiento de la función y la selectividad farmacológica de los receptores Cys-loop y contribuye a determinar su potencial como un nuevo blanco para la terapia antihelmíntica REFERENCIAS: -Ranganathan, R., Cannon, S. C., & Horvitz, H. R. (2000). MOD-1 is a serotonin-gated chloride channel that modulates locomotory behaviour in C. elegans. Nature, 408(6811), 470..-Bouzat C, Bartos M, Corradi J, and Sine SM (2008) The interface between extracellular and transmembrane domains of homomeric Cys-loop receptors governs openchannel lifetime and rate of desensitization. J Neurosci 28:7808?7819.-Rodriguez Araujo, N., Fabiani, C., Mazzarini Dimarco, A., Bouzat, C., & Corradi, J. (2020). Orthosteric and Allosteric Activation of Human 5-HT3A Receptors. Biophysical journal, 119(8), 1670?1682. https://doi.org/10.1016/j.bpj.2020.08.029-Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans (February 11, 2006), WormBook, ed. The C. elegans Research Community, WormBook. doi/10.1895/wormbook.1.101.1. http://www.wormbook.org.