Bases farmacológicas de la actividad antihelmíntica de los aceites esenciales exploradas en el nematodo Caenorhabditis elegans

HERNANDO, G.; TURANI, O.; BOUZAT, C.

Campeche

Congreso; IX congreso iberoamericano de ciencias farmacéuticas de COIFFA en línea - 2021 y expo póster virtual COIFFA 2021.; 2021

Conferencia Iberoamericana de Facultades de Farmacia (COIFFA); Facultad de Ciencias Químico Biológicas (FCQB); Universidad Autónoma de Campeche (UAC).

INTRODUCCIÓN: El control de las infecciones por helmintos en la medicina humana y veterinaria se basa principalmente en la quimioterapia, los nematodos parásitos causan sustanciales muertes y morbidez en humanos y pérdidas en el ganado y animales domésticos. La resistencia parasitaria a fármacos antihelmínticos representa un problema serio en la mayoría de los sistemas productivos del mundo, que lleva a la urgente necesidad de descubrir nuevos fármacos. El nematodo de vida libre Caenorhabditis elegans ha demostrado ser un sistema modelo para el descubrimiento de nuevos antihelmínticos y para caracterizar sus mecanismos de acción y resistencia. Los receptores ?Cys-loop? musculares de nematodos son de importancia clínica porque son blancos de drogas antihelmínticas. C. elegans es entonces una valiosa plataforma para el estudio de blancos antihelmínticos porque comparte características fisiológicas y farmacológicas con los nematodos de vida parasitaria, y es sensible a la mayoría de las drogas antihelmínticas. En este trabajo nosotros exploramos a diferentes niveles los receptores involucrados en la coordinación de la locomoción de los gusanos. En C. elegans los músculos de la pared del cuerpo reciben innervación de las neuronas motoras colinérgicas (excitatorias) y GABAérgicas (inhibitorias). La acetilcolina (ACh) liberada desde las neuronas motoras estimula la contracción muscular sobre un lado del cuerpo, y simultáneamente activa una neurona motora inhibitoria que se proyecta hacia el lado opuesto del cuerpo y libera GABA, el cual relaja los músculos. C. elegans contiene un receptor de GABA y dos tipos farmacológicamente diferentes de receptores de ACh (AChR), el AChR sensible a levamisol (L-AChR) y el AChR sensible a nicotina (N-AChR). Los aceites esenciales (AE) son productos naturales producidos por diversas plantas aromáticas; hasta la fecha, aproximadamente 300 aceites se encuentran en uso comercial. Los AE son mezclas complejas de varios compuestos, en los que están presentes dos o tres fitoquímicos principales en concentraciones más altas. OBJETIVO: Evaluar el potencial antihelmíntico de los AE y sus principales constituyentes y, descifrar las bases moleculares de su actividad. METODOLOGÍA: Las cepas utilizadas fueron cedidas por el Caenorhabditis Genetic Center. El cultivo de las mismas lo realizamos de acuerdo al protocolo descripto por Stiernagle detallado en WormBook (Stiernagle, 2006). Ensayo de parálisis en placas de agar: Por medio de este ensayo monitoreamos la sensibilidad de C. elegans al efecto paralizante de diferentes agentes antihelmínticos. Para ello, los gusanos son sincronizados en edad, y luego agregados a las placas conteniendo o no el compuesto de estudio (tratamiento y control). Locomoción en medio líquido: Los nematodos sincronizados en estadio adulto joven son transferidos a microplacas de 96 pocillos. Se utiliza un promedio de 50 nematodos por pocillo. Se cuantifica la locomoción basal de los nematodos dentro de los pocillos mediante una luz infrarroja del dispositivo WMicrotracker (Designplus SRL, Argentina). Luego de medir la actividad basal, se agrega la droga en estudio y se cuantifica la actividad durante la incubación con la misma. Ensayo de eclosión de huevos: Aproximadamente 300 - 500 huevos son colocados en tubos Eppendorf conteniendo buffer o agua, agua con DMSO como vehículo o DMSO con los compuestos a testear. Se los incuba durante 4 horas a 22 °C y luego se los lava con agua para recuperarlos. Finalmente, se los coloca en placas de Petri nuevas con NGM nuevo, y se cuenta el número de huevos sin eclosionar y de larvas L1 utilizando un microscopio estereoscópico con zoom. Aislamiento de células embrionarias: Se realiza un protocolo de aislamiento de células embrionarias de C. elegans que luego de 24 hs en cultivo se diferencian a células musculares correspondientes al primer estadio larval L1 (Christensen et al., 2002). Registros de canal único: Las corrientes de canal único son registradas en la configuración cell-attached. Los canales se registran a potencial de membrana de -100 mV (Hernando et al., 2019). RESULTADOS: Los Aceites Esenciales inhiben la locomoción de C. elegans en función del tiempo y la concentración, y la eclosión de los huevos, una propiedad relacionada con la capacidad antihelmíntica. Investigamos la sensibilidad de los gusanos adultos expuestos a los AE en función del tiempo y la concentración. Los gusanos de tipo salvaje sincronizados en la etapa de adulto joven se colocaron en placas de agar que contenían los AE en diferentes concentraciones y se observaron en diferentes momentos para determinar la fracción de gusanos que responden al tacto suave (no paralizados), los cuales fueron considerados "gusanos en movimiento". Con la realización de esta prueba obtuvimos la concentración efectiva 50 (EC50), que es la concentración, expresada en porcentaje, de AE necesaria para generar parálisis en el 50% de los nematodos. El Trans-cinamaldehído, geraniol, citronelol, linalol y el acetato de linalilo inhiben la locomoción de C. elegans evaluado mediante un ensayo de actividad automático. Investigamos la sensibilidad de los gusanos adultos expuestos a los componentes mayoritarios presentes en los AE en función del tiempo y la concentración mediante el uso de un ensayo de movimiento automatizado.Para determinar si los AE afectan la eclosión de los huevos, realizamos la prueba de eclosión de huevos con modificaciones para C. elegans. Los huevos de C. elegans se expusieron al buffer M9 (control) y se utilizó la EC50 de AE o TC calculada para el estado adulto de tipo salvaje, y se determinó el porcentaje de huevos sin eclosionar.Descifrando los blancos moleculares que median los efectos de los aceites esenciales: los nematodos mutantes que carecen de los receptores de GABA o L-AChR muestran una resistencia parcial a los aceites. En la cepa mutante unc-38(e264), que carece de L-AChRs funcionales debido a la ausencia de la subunidad esencial UNC-38, la fracción de gusanos paralizados después de la exposición a AE (EC50) se redujo notablemente con respecto a los gusanos de tipo salvaje, especialmente durante la primera hora de exposición. De igual modo, la cepa mutante unc-49 (e407) también fue parcialmente resistente a los AE. Asimismo, ambas cepas mutantes revelaron una resistencia parcial al TC. El trans-cinamaldehído disminuye la actividad de canal único de los L-AChR provocados por la ACh. Para confirmar inequívocamente que estos receptores son blancos del TC y para describir el mecanismo por el cual afectan a los mismos, realizamos registros de electrofisiología a partir de células musculares de C. elegans. Por medio de ensayos de canal único desciframos como los L-AChR C. elegans son modulados por el TC. Los registros electrofisiológicos revelaron que el TC reduce la actividad del canal L-AChR sin afectar sus propiedades. CONCLUSIONES: Identificamos seis aceites esenciales como nuevas fuentes potencialesde compuestos antihelmínticos, todos actuando sobre los receptores musculares de C. elegans.Los aceites esenciales inhiben la locomoción de C. elegans en función del tiempo y la concentración, median los efectos a corto plazo e inhiben la eclosión de los huevos, por lo que median los efectos a largo plazo. El orden de potencia detectado es C. verum (0,015%)> D. sissoo (0,10%)> N. cataria (0,15%)> M. alternifolia (0,20%)> C. bergamia (0,50%)> Z. officinale (1,20%)). El trans-cinamaldehído, geraniol, citronelol, linalol y acetato de linalilo inhiben la locomoción de C. elegans en función del tiempo y la concentración, lo que es compatible con la participación de canales iónicos activados por ligandos. Los gusanos que carecen de receptores UNC-49 (GABA) o L-AChR son parcialmente resistentes a estos compuestos. Por tanto, estos dos receptores son blancos de los AE. Asimismo, los mutantes son parcialmente resistentes al TC. Los resultados indican que estos receptores están claramente implicados en la parálisis inducida por el TC. Por medio de ensayos de canal único desciframos como los L-AChR de células musculares en el estadio L1 de C. elegans son modulados por el TC. Los registros electrofisiológicos revelaron que el TC reduce la actividad del canal L-AChR sin afectar sus propiedades. Los resultados son compatibles con la acción de estos fármacos como inhibidores alostéricos. Los efectos del TC a nivel molecular están relacionados con los efectos comportamentales en ensayos de parálisis y de actividad automática. El estudio de la farmacología de la actividad antihelmíntica de los AE y sus componentes principales en los receptores ?Cys-loop? en un organismo genéticamente manipulable y modelo de nematodos parásitos provee nuevas avenidas de exploración para drogas selectivas, como también para definir los determinantes estructurales de la activación y modulación en la familia de receptores ?Cys-loop? y sentar las bases moleculares de la adquisición de resistencia a fármacos antihelmínticos. REFERENCIAS:1.Christensen M., Ana Estevez A., Yin X., Fox R., Morrison R., McDonnell M., Gleason C.; Miller III D.M., and Strange K. (2002). A Primary Culture System for Functional Analysis of C. elegans Neurons and Muscle Cells. Neuron. 33, 503?514. 2.Hernando G., Turani O., Bouzat C. (2019). Caenorhabditis elegans muscle Cys-loop receptors as novel targets of terpenoids with potential anthelmintic activity. PLoS Negl Trop Dis 13(11):e0007895. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0007895.3.Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans (February 11, 2006), WormBook, ed. The C. elegans Research Community, WormBook. doi/10.1895/wormbook.1.101.1. http://www.wormbook.org.