La vinculina es transportada en el citosol asociada a la membrana de vesículas en forma periférica

BRANDAN YAMILA; GUAYTIMA EDITH; MARIA BELEN DE LA VEGA; FAVALE NICOLAS; STERIN SPEZIALE NORMA; MARQUEZ MG

La Rioja

Jornada; II JORNADAS DE VINCULACIÓN Y TRANSFERENCIA CIENTÍFICA Y TECNOLÓGICA DE LA PROVINCIA DE LA RIOJA; 2013

Subsecretaría de Ciencia y Tecnología del Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología de La Rioja

La vinculina es una proteína que forma parte de estructuras de adhesión celular, como son las uniones adherentes ? que median la unión entre las células- y los contactos focales (CF) ? que son estructuras multiproteicas que unen las células con la matriz extracelular. Existe un pool citoesquelético y un pool citosólico de vinculina, éste último representado por la vinculina que no forma parte de las estructuras de adhesión. La bradiquinina (BK) es una hormona intrarrenal cuyo efecto vasoactivo es bien conocido. Trabajos previos realizados en nuestro laboratorio demostraron que la BK ejerce un efecto modulatorio sobre las estructuras de adhesión que mantienen unidas las células del túbulo colector de la papila renal con la matriz extracelular. Específicamente hemos observado que la BK induce una reestructuración de los CF, movilizando vinculina por un mecanismo que involucra la hidrólisis de fosfatidilinositol-4,5-difosfato (PIP2), y a tiempos prolongados de estimulación, los CF conteniendo vinculina vuelven a formarse. Este proceso ocurre con la aparición simultánea en el citosol de vesículas que contienen vinculina, PIP2 y marcadores del compartimiento de reciclaje endosomal, como Rab 5 y 11 y el receptor de transferrina. El objetivo de este trabajo fue caracterizar bioquímicamente estas vesículas estudiando la naturaleza de la asociación de vinculina a la membrana, su orientación, y la composición lipídica de la membrana de las mismas. Para tal fin, obtuvimos una fracción subcelular enriquecida en vesículas (fracción microsomal, FM) de células del túbulo colector de papila renal de ratas previamente incubadas con BK. Para analizar la naturaleza de la asociación de vinculina con la membrana, incubamos alícuotas de FM con soluciones de KCl de fuerza iónica creciente, y de Na2CO3 (pH 10). También realizamos un ensayo de partición en detergente utilizando una solución acuosa de Tritón X-114. El estudio de la orientación de vinculina en la membrana de las vesículas se realizó con el ensayo de resistencia a la hidrólisis por proteasa (tripsina) en ausencia y presencia de Tritón X-100. Se analizó la presencia de vinculina por Western blot. El análisis de la composición fosfolipídica de las membranas se realizó por cromatografía en capa delgada (TLC) a partir de vesículas aisladas de la FM por métodos inmunomagnéticos. Observamos que a mayor fuerza iónica y alcalinidad, mayor es la cantidad de vinculina extraída de las vesículas, y se ubica en la fase acuosa frente al tratamiento con Tritón X-114. La vinculina fue completamente degradada por acción de tripsina, incluso en ausencia de Tritón X-100. La TLC reveló la presencia de fosfatidilcolina y esfingomielina en las membranas de las vesículas. Sobre la base de estos resultados concluimos que la vinculina cuando no forma parte de los CF, se inserta en la membrana de vesículas que pertenecen al compartimiento de reciclaje en forma periférica, probablemente por interacciones electrostáticas, y orientada hacia el citosol. La formación de estas vesículas podría representar un mecanismo fisiológico por el cual la célula reutiliza el pool citosólico de vinculina para la formación de estructuras de adhesión como lo son los CF.