DERIVADOS DE CUMARINAS Y SU ACTIVIDAD FRENTE A TRANSCRIPTASA REVERSA

H. A. GARRO; M. J. MANZUR; G. M CIUFFO; M. KURINA SANZ; C. R. PUNGITORE

S. M. de Tucumán

Congreso; XXVII CONGRESO ARGENTINO DE QUIMICA; 2008

A.Q.A

DERIVADOS DE CUMARINAS Y SU ACTIVIDAD FRENTE A TRANSCRIPTASA REVERSA Hugo Garro;1 María Jimena Manzur;2 Gladys Ciuffo;2 Marcela Kurina;1* Carlos Pungitore;1* 1INTEQUI-CONICET, 2Laboratorio de Biología Molecular, Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia. Universidad Nacional de San Luis. Chacabuco y Pedernera, CP: 5700 San Luis, Argentina. Fax: +54 2652 422 644. E-mail: crpungi@unsl.edu.ar o mkurina@unsl.edu.ar Introducción. Los retrovirus son una clase particular de agentes infecciosos que presentan ARN como material genético, y pueden dar origen a patologías severas como la leucemia humana de células T y al SIDA. Se distinguen por llevar dentro de su partícula infectiva un tipo de ADN polimerasa dependiente de ARN conocida como transcriptasa reversa (TR). En la actualidad se conocen con detalle las estructuras tridimensionales de varias TR, incluyendo la del virus de la leucemia mieloide murina (MMLV, por sus siglas en inglés) y su homóloga en el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1). Dicha proteína es un enzima clave dentro del ciclo vital y representa uno de los principales blancos moleculares de terapia antiviral [1]. La principal clase de compuestos activos aprobados clínicamente corresponde a análogos nucleosídicos capaces de interrumpir la síntesis de ácidos nucleicos, como el caso del AZT, en donde un grupo oxidrilo 3’ de ribosa es reemplazado por un motivo azido. Desafortunadamente los eventos moleculares de replicación viral son extremadamente susceptibles al origen de mutaciones, las que se traducen en la aparición de mecanismos de resistencia a fármacos. Esta continua batalla evolutiva nos lleva a la búsqueda de novedosas moléculas bioactivas, capaces de inhibir selectivamente estas enzimas, las cuales podrían actuar como potenciales fármacos quimioterapeúticos [2]. En nuestro grupo de investigación se viene desarrollando desde hace algunos años un estudio interdisciplinario de búsqueda de inhibidores de enzimas relacionadas al ADN [3-5]. En el presente trabajo se aborda el estudio de la actividad inhibitoria de un grupo de cumarinas frente a la enzima Transcriptasa Reversa. Metodología. Las cumarinas utilizadas fueron obtenidas de Aldrich y Sigma, con las excepciones de  7-hidroxicumarina (7), la cual fue aislada de la especie vegetal Quincha mali (Scrophulariaceae) y 5-hidroxicumarina, obtenida por transformación enzimática. La caracterización estructural de los compuestos se llevó a cabo mediante RMN. La purificación de los productos obtenidos por transformaciones enzimáticas se logró mediante diferentes técnicas cromatográficas, tales como cromatografía gaseosa, en columna y en placa delgada. En los procedimientos de bioconversión a célula entera (“growing cells”) se emplearon cepas de Aspergillus flavus, A. niger y A. terreus en un medio de cultivo líquido denominado harina de soja. Para los procedimientos de células restringidas (“resting cells”) se empleo “buffer” fosfato diácido de potasio. El proceso de bioconversión en ambos casos se realizó mediante un método en dos etapas, el cual consistió de un precultivo de esporas durante 48 hs sin sustrato para su posterior repique y finalmente del agregado de 10 mg de sustrato por “batch” en un volumen final de 30 ml. El tiempo de incubación varió de 5 a 14 días en la etapa de subcultivo. Los ensayos de inhibición en la reacción de transcripción inversa se llevaron a cabo con la enzima transcriptasa reversa del virus de la leucemia mieloide murina y los productos de reacción fueron amplificados mediante técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés), empleado como templado el plásmido p-gemT-AT2, el cual codifica para el receptor de angiotensina II murina. Como control negativo de inhibición se empleó agua mQ sin el agregado de compuestos y como control positivo de la reacción de RT-PCR se empleó ddATP. Resultados y Discusión. A partir del sustrato cumarina (1), se pudo obtener el derivado selectivamente hidroxilado en la posición cinco, mediante las especies fúngicas A. flavus y A. niger, tanto con el método de cultivos en crecimiento (“growing cells”) como de células restringidas (“resting cells”), estandarizando una metodología novedosa y aceptable  desde el punto de vista ecológico para la preparación de 5-hidroxicumarina (8). Una vez obtenido este derivado se procedió a ensayar la actividad inhibitoria a una concentración de 250 μM sobre TR del MMLV de los siguientes metabolitos: cumarina (1), cumaranona (2), 3-acetilcumarina (3), 3-hidroxicumarina (4), 4-hidroxicumarina (5), 6-hidroxicumarina (6), 7-hidroxicumarina (7) (umbelliferona) y 5-hidroxicumarina (8) (Figura 1.), obteniéndose un resultado positivo para el compuesto (1). Posteriormente se pudo determinar una actividad inhibitoria del tipo dosis-dependiente para este metabolito sobre la reacción de transcripción reversa, con un valor de IC50 igual a 38,62 ± 3,25 μM [2]. Figura 1. Familia de cumarinas ensayada frente a TR. La información concerniente a las características estructurales de inhibidores de este tipo de proteínas permitiría obtener pruebas para el entendimiento del rol que juegan estas enzimas específicas en los mecanismos de replicación y retrotranscripción viral, además de poder convertirse cumarina (1) en un compuesto “líder” para el desarrollo de fármacos antivirales. Conclusiones. En resumen, se evaluó la actividad inhibitoria de una familia de cumarinas sobre la transcriptasa reversa del virus de la leucemia mieloide murina, resultando el compuesto (1), un inhibidor de la reacción de transcripción inversa. Este compuesto podría ser de considerable valor para realizar futuros estudios concernientes a la relación estructura-actividad, y comportarse además como una molécula “líder” para el desarrollo de fármacos anti-retrovirales. Referencias. [1].  Gotte, M. Expert Rev. Anti Infect. Ther. (2004), 2 : 707-716. [2].  Garro, H. Tesis de Licenciatura, (2008). [3].  Pungitore et al J. Nat. Prod. (2004), 67: 357-361. [4].  Pungitore et al Cell. Mol. Biol. (2004), 50: 767-772. [5].  Pungitore et al Cell. Mol. Biol. (2007), 53: 13-17.