Obtención de ADN a partir de tumores embebidos en parafina para evaluación de Microsatélites

CALLERO, MARIANA; LANDI, CAROLINA; FORNES, CLAUDIA; CHIALINA, SERGIO; SOLIS, EDITA

Hospital Italiano Garibaldi

Jornada; VII Jornadas de Divulgación científica del Hospital Italiano Garibaldi y I Jornadas del Instituto Universitario Italiano de Rosario; 2001

Hospital Italiano Garibaldi

Los tejidos para análisis anatomopatológicos, en su mayoría, son fijados con formaldehído e incluidos en tacos de parafina. A pesar, que la arquitectura y las proteínas del tejido se preservan de esta forma, la extracción de ácidos nucleicos puede ser difícil resultando solamente, en la obtención de ADN degradado. Sin embargo, estas muestras son una fuente invalorable de estudios moleculares. La técnica más utilizada para el aislamiento de ADN a partir de estos tejidos es la extracción con solventes orgánicos luego de la remoción de parafina y digestión con proteinasa K. De acuerdo con la bibliografía (Pavelic, K. Neoplasma , 1996, 43, 75-81 ; Shibata, D. Hum Pat, 1994, 25, 561-563; Poljak, M. Eur J of Phys, 2000,439, 42-44; Coombs, N. Nuc Acid Res, 1999, 27, 114-118) esta técnica puede realizarse según distintas variantes  con diferentes resultados, por lo que planteó la necesidad de optimizarla. Para ello, cada uno de los pasos que conforman la técnica fueron optimizados de manera  secuencial a partir de una  única  muestra:  1)  desparafinización  con  xilol, 2) cortes y espesor del tejido, 3) concentraciones de proteinasa K,   4) tiempo de digestión, 5) extracciones con solventes orgánicos. Se evaluó cantidad y calidad de ADN obtenido por espectrofotometría (Absorbancia 260/Absorbancia 280) y en gel de agarosa. La técnica finalmente adoptada consiste en dos incubaciones con xilol  de 2 a 5 minutos de 2 cortes de 5 mm de espesor, digestión enzimática con una concentración de proteinasa K de 0.25 mg/ml a 55°C durante 3 horas, doble extracción con fenol cloroformo y precipitación con Isopropanol y Acetato de Potasio 7.5M. Los ADN obtenidos con esta técnica fueron evaluados con un sistema de microsatélites denominado BAT26 que se utiliza en el screening de inestabilidad de microsatélites en Cáncer de Colon No Polipoideo Hereditario. La eficiencia de esta técnica se comprobó con 16 muestras de diferentes tumores de colon. En el 62.5% de las muestras se obtuvo ADN en cantidad y calidad suficientes. De las cuales el 100% presentó producto específico, para el marcador citado anteriormente, al ser amplificadas por PCR. Los resultados con esta técnica fueron superiores a los obtenidos por  métodos con características similares. (Coombs, N. Nuc Acid Res, 1999, 27, 114-118).