Primera secuencia de ADN mitocondrial de Alaria alata procedente de zorro gris pampeano (Lycalopex gymnocercus) de Argentina

ROMINA PETRIGH; NATHALIA PAULA SCIOSCIA; GUILLERMO DENEGRI; MARTIN FUGASSA

Congreso; III Congreso Panamericano de Zoonosis; 2014

INTRODUCCIÓN Los parásitos pertenecientes al género Alaria (Clase Trematoda, Familia Diplostomatidae) parasitan el intestino delgado de félidos, cánidos, mustélidos y prociónidos de Europa Australia y América. En la actualidad se han reportado varios casos de alariosis en humanos, por lo tanto este parásito representa un riesgo para la salud pública. Dada su importancia zoonótica, la identificación específica de los parásitos del género Alaria representa un desafío para los parasitólogos. Distintas especies de Alaria han sido halladas en América del Norte y del Sur: Alaria alata, A. mustelae, A. intermedia, A. marcianae, A. arisaemoides, A.canis (sin. A. americana) y A. taxideae. En Argentina el primer hallazgo de Alaria sp. data del año 1963 aislándose de perro (Canis familiaris) y posteriormente se describe A. alata en zorro de monte (Cerdocyon thous) y en gato montés (Oncyfelis geoffroyi). Además, en un estudio reciente se hallaron huevos Alaria sp. en heces de diferentes carnívoros silvestres del Noreste Argentino. Si bien el adulto de Alaria spp. presenta caracteres morfológicos que permiten identificar especie, no siempre se puede contar con este estadio y hay escasos datos morfológicos y morfométricos del resto de los estadios. En este trabajo se utilizó la amplificación y secuenciación de un fragmento de ADN mitocondrial para generar la primera información genómica de Alaria sp. procedente de materia fecal de zorro gris pampeano de la provincia de Buenos Aires, Argentina. MATERIALES Y MÉTODOS La materia fecal analizada en este estudio fue recolectada del recto durante la necropsia de una hembra adulta de zorro gris pampeano, cazada durante la temporada de caza comercial habilitada para esta especie en el partido de Azul. Se realizó el aislamiento de los huevos de trematodes de forma manual bajo un microscopio óptico, luego los huevos se lavaron varias veces con PBS 1X sobre el cubreobjetos. Los huevos se rompieron manualmente y se onservaron en PBS 1X estéril a -20°C hasta su uso. El ADN se extrajo de 2 conjuntos de 4 huevos cada uno y se amplificó por PCR un fragmento de 450 pb (pares de bases) del gen mitocondrial que codifica para la subunidad I de la citocromo oxidasa (cox1). Los fragmentos génicos fueron secuenciados. La secuencia de nucleótidos consenso obtenida fue comparada con secuencias nucleotídicas del GenBank utilizando el algoritmo BLASTN). Por otra parte se hallaron trematodes en intestino, se lavaron con solución salina al 9% y luego se fijaron en formol al 4%. Para su identificación morfológica fueron teñidos con carmín clorhídrico, deshidratados, diafanizados con creosota, montados en bálsamo de Canadá y observados en microscopio óptico. RESULTADOS Los fragmentos génicos secuenciados procedentes de los dos conjuntos de huevos analizados resultaron idénticos. Los resultados de la comparación de la secuencia consenso con las secuencias nucleotídicas depositadas en las bases de secuencias no redundantes (BLASTN) mostraron un 91% de identidad con cuatro secuencias de A. alata obtenidas de aislamientos de Europa. La secuencia obtenida fue publicada en el NCBI como Alaria sp (Número de Acceso: KF572949). La identificación morfológica de los adultos hallados en el intestino del zorro gris pampeano correspondió a A. alata. DISCUSIÓN Si bien los resultados del análisis molecular presentados no tienen 100% de identidad con las secuencias existentes hasta el momento de A. alata, la identificación morfológica de trematodes adultos hallados en el intestino del mismo zorro que se analizó los huevos de Alaria, permitió confirmar a este parásito como A. alata. Las diferencias observadas en el análisis molecular pueden deberse a la gran variabilidad genética que existe en la secuencia del gen cox1. La aplicación de estas herramientas moleculares permitió generar la primer secuencia de A. alata procedente de Argentina. Estos resultados aportan información genotípica de los parásitos de este género, para realizar comparaciones inter e intra específicas y futuros estudios poblacionales pudiendo aplicar técnicas no invasivas. Además esta herramienta de identificación y caracterización molecular podrá ser aplicada para la identificación de los otros estadios de este parásito dado que morfológicamente resulta dificultoso como en el caso de las mesocercarias. BIBLIOGRAFÍA Möhl K, Grosse K, Hamedy A, Wüste T, Kabelitz P, Lücker E. Biology of Alaria spp. and human exposition risk to Alaria mesocercariae-a review. Parasitol Res Jul 2009; 105(1):1-15. Review Riehn K, Hamedy A, Alter T, Lücker E. Development of a PCR approach for differentiation of Alaria spp. mesocercariae. Parasitol Res. May 2011; 108(5):1327-32. Rigonatto TM, Felix AN, Sandra E., Troiano JC, Gauna AL, Duchene A, Stancato MR, Juega Sicardi JA. Hallazgo de Alaria sp. (Trematoda, Strigeiidae) en carnívoros silvestres. Comunicaciones Científicas y Tecnológicas. Universidad Nacional del Nordeste. Corrientes Argentina 2000. Comunicación 040. Disponible en: http://www.unne.edu.ar/unnevieja/Web/cyt/cyt/2000/cyt.htm