Impacto del Remodelamiento de envoltura en la exposición de proteínas heterólogas sobre la superficie de BAL mediante la endolisina del fago PL-1.

GORDILLO TANIA; GRADASCHI VICTORIA; BOCKOR SABRINA; ALLIEVI MARIANA C; PIURI MARIANA; RUZAL SANDRA M.; MARÍA MERCEDES PALOMINO

Jornada; II Jornadas Latinoamericanas de Bacteriófagos; 2022

Las Bacterias Ácido Lácticas (BAL), han sido consideradas microorganismos con status GRAS (Generalmente Reconocidos como Seguros), asociados a la fermentación y preservación de alimentos. Además, muchas cepas presentan características probióticas. La endolisina del fago PL-1 de Lacticaseibacillus paracasei tiene una estructura bi-modular con un dominio catalítico con actividad muramidasa en su extremo N-terminal y un dominio de unión a pared celular (CBD) en su extremo C-terminal. Este último puede ser utilizado como dominio ?carrier?, para la exhibición en superficie de BAL de péptidos o proteínas de interés industrial y/o farmacéutico. El objetivo principal del presente trabajo es evaluar el CBD de la endolisina del fago PL-1 como dominio de anclaje para unir proteínas funcionales a la superficie de BAL no modificadas genéticamente y cómo los cambios en envoltura que surgen de una pre adaptación a condiciones de hipersalinidad podrían influir en esta unión. Para ello, en primer lugar, se produjo la proteína quimera GFP-CBDLys en un sistema de expresión heterólogo en E. coli para posteriormente realizar los ensayos de binding sobre la superficie de BAL. Los mismos fueron evaluados por microscopía de fluorescencia y citometría de flujo. De esta forma se consigue una formulación de grado alimentario que no contenga microorganismos genéticamente modificados, prevaleciendo el status seguro de los mismos. Por otro lado, hemos evaluado cómo influyen los cambios estructurales a nivel de envoltura en el binding del CBD cuando L. paracasei es pre crecido en presencia de distintas concentraciones de NaCl. Se ha observado un aumento significativo del binding de 2,5 veces cuando L. paracasei es pre crecido en MRS 0,75M. El análisis de expresión por medio de la técnica qPCR de distintos genes de síntesis de los principales polímeros de pared (CWPS y LTA) ha demostrado una inhibición en la expresión de los mismos cuando L. paracasei es pre adaptado en alta sal. Además, se estudió si las células decoradas en alta densidad con la proteína ?carrier? como también las modificaciones que ocurren a partir de la pre adaptación en alta sal podrían influir en el proceso infeccioso fago-bacteria, para ello se realizaron cinéticas de adsorción de PL-1 a L. paracasei comparando condición control contra tres tipos celulares. Se observó que no hay diferencias en la cinética de adsorción de la cepa decorada con la proteína ?carrier?, sin embargo se observó una disminución significativa cuando la misma es precrecida en alta sal. Estos resultados destacan el potencial uso de microorganismos genéticamente no modificados para el delivery de biomoléculas mediada por el CBD de la endolisina del fago PL-1, se ha corroborado que el pre crecimiento en alta sal permite maximizar la exhibición de proteínas heterólogas sobre la superficie de BAL. Las modificaciones que ocurren a nivel de polímeros de pared a partir de análisis de expresión podrían explicar la optimización de la exhibición como también las diferencias observadas en las cinéticas de adsorción.