Selección de factores significativos en el cultivo de microorganismos oleaginosos

GIORDANO, PABLO CESAR; BECCARIA, ALEJANDRO JOSE; GOICOECHEA, HECTOR CASIMIRO

La Plata-Argentina

Simposio; 2do Simposio Argentino de los Procesos Biotecnológicos; 2012

Universidad Nacional de La Plata

Existe una creciente demanda de combustibles para diferentes propósitos y, asociado a esto, se encuentra desarrollada una tecnología muy eficiente para la conversión de la energía química contenida en ellos en otros tipos de energía y trabajo mecánico. Para este fin, se emplean masivamente combustibles líquidos de origen fósil, que constituyen el clásico ejemplo de recurso no renovable. Además, el ingreso a la biosfera del carbono contenido en los mismos, podría desencadenar serios trastornos ambientales mediante el proceso denominado “efecto invernadero” [ ]. Un aporte a la solución del problema del agotamiento, propiedad de los recursos no renovables, y de evitar los trastornos ambientales predecibles, es reemplazar el uso de los combustibles fósiles por biocombustibles [ ]. Dentro de los biocombustibles líquidos se destaca el biodiesel, el que está constituido químicamente por ésteres de monoalcoholes de cadena corta con ácidos grasos [ ]. Los ácidos grasos provienen mayoritariamente del aceite contenido en organismos vegetales oleaginosos, los que constituyen la materia prima para la obtención del biodiesel [2]. Este producto se consolida ecológicamente debido a la capacidad de fijación fotosintética del dióxido de carbono atmosférico, usado como nutriente por las plantas. Sin embargo, el empleo de fuentes vegetales para la síntesis de combustibles, trae asociado ciertos inconvenientes relacionados a la distracción de recursos alimenticios y al empobrecimiento de los suelos [ ]. Una alternativa al empleo de vegetales cultivados para la producción de biodiesel, es el empleo de microorganismos oleaginosos, productores del denominado “aceite unicelular” (SCO – Single Cell Oil) [ ]. Este aceite, mediante un proceso posterior de esterificación con monoalcoholes, puede ser transformado en biodiesel, el principal biocombustible líquido [3]. Esta alternativa resulta muy promisoria para reducir el empleo de combustibles fósiles y para evitar la distracción de vegetales oleaginosos en la síntesis de combustibles [5]. En el presente trabajo se planteó un diseño factorial para estudiar la significancia de 8 factores en el cultivo heterotrófico de una microalga oleaginosa (Chlorella sp.) sobre el rendimiento celular y el contenido de lípidos [ ].  Metodología Se empleó la microalga Chlorella sp. (UTEX 1822). La misma fue mantenida en medio Bold 3N modificado, a 30 °C, repicándola cada 15 días. Se realizaron 12 experimentos que consistieron en diferentes formulaciones de medios de cultivo, basados en el medio Bold 3N modificado. Los factores y sus niveles evaluados fueron: densidad celular inicial (DCi) (5 x 105–1 x 106 céls.mL-1), agitación (A) (0-200 rpm), tipo de fuente de nitrógeno (FN) (extracto de levadura-KNO3), tipo de fuente de carbono (FC) (glucosa-glicerol), relación carbono/nitrógeno (C/N) (10-20) y concentraciones de: fuente de carbono (C) (5-25 gL-1), sulfato de zinc (Zn) (0.2-1 mgL-1), sulfato de cobre (Cu) (0.1-0.3 mgL-1). De cada medio se dispensó un volumen de 10 mL en frascos Erlenmeyer y su pH se ajustó a 6.2 unidades previo a la esterilización (121°C, 15 min.). Posteriormente se inoculó con una alícuota de un cultivo de la cepa en c.s.p. lograr la densidad celular requerida. Todas las incubaciones se realizaron a 30 °C. A los 10 días de la inoculación, se cuantificó la biomasa espectrofotométricamente (682 nm), para luego obtener la densidad celular mediante el empleo de una curva de calibrado. Posteriormente, el contenido lipídico (en ppm) se determinó espectrofluorimétricamente (λexcitación = 430 nm, λemisión = 486 nm). Como testigo se empleó una emulsión de aceite vegetal comercial en una mezcla de isopropanol y agua. Finalmente, ambos resultados se combinaron para obtener una sola respuesta: el rendimiento lipídico específico celular (ppm/1 x 106 células).  Resultados y conclusiones Los datos obtenidos se ingresaron al diseño experimental y se analizaron con la ayuda de programas informáticos. Los factores DCi, A, FN y Zn resultaron no tener significancia en la respuesta, al menos en el rango evaluado. La Tabla 1 resume la significancia de cada uno de los factores evaluados y sus interacciones (basadas en el valor de probabilidad (p)), el efecto que ejercen sobre la respuesta, y el valor del coeficiente de determinación (R2). Tabla 1: valores de p y efecto sobre la respuesta para cada uno de los factores evaluados y sus interacciones de primer orden Factor Interacción DCi A FN FC C/N C Zn Cu FC-C C/N-Cu Valor de p - - - 0.041 0.006 - - 0.036 0.051 0.034 Efectoa - - - ↑ ↓ - - ↑ ↓ ↓ R2 0.8938 a↑: efecto positivo; ↓: efecto negativo. Sobre la base de estos resultados, los factores a tener en cuenta en una posterior fase de optimización (aplicando la metodología de superficie de respuesta) son: relación carbono/nitrógeno, concentración de la fuente de carbono y concentración de sulfato de cobre. Por otra parte, se mantendrán constantes los siguientes factores: DCi: 5 x 105 céls.mL-1, A: 0 rpm, FN: extracto de levadura, FC: glucosa, Zn: 0.2 mgL-1. En conclusión, mediante la aplicación de herramientas quimiométricas fue posible seleccionar los factores significativos que afectan en el rendimiento lipídico en el cultivo de una microalga oleaginosa. De esta manera, se prevé continuar el trabajo aplicando dichas herramientas para optimizar la composición de un medio de cultivo y diseñar una estrategia fed-batch a escala de laboratorio a fin de maximizar el rendimiento de SCO.