Optimización de un medio de cultivo conteniendo glicerol de desecho para Escherichia coli recombinante. Aplicación de herramientas quimiométricas avanzadas

PABLO C. GIORDANO; HUGO D. MARTINEZ; ALBERTO A. IGLESIAS; ALEJANDRO J. BECCARIA; HECTOR C. GOICOECHEA

Rosario, Santa Fe

Simposio; 1er Simposio Argentino de los Procesos Biotecnológicos; 2010

Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmaceúticas-UNR

Escherichia coli es el sistema procariótico de expresión más empleado en los procesos de producción de proteínas recombinantes debido a que su fisiología y genética están muy bien caracterizadas, y puede ser cultivada con relativa facilidad. E. coli se desarrolla frecuentemente en medio LB (triptona 10 g L-1, extracto de levadura 5 g L-1 y cloruro de sodio 10 g L-1), que tiene una baja relación carbono/nitrógeno. Una alternativa para mejorar la formulación es incorporar componentes ricos en carbono, de bajo o nulo valor comercial que incrementen aquella relación, además de la productividad del proceso. El glicerol ha sido estudiado como fuente de carbono de muy bajo costo ya que la expansión de la producción de biodiesel ha desembocado en el aumento de su disponibilidad. Al formularse un medio de cultivo, un paso clave es optimizar la proporción de sus componentes ya que la relación entre estos influye directamente en el rendimiento del proceso. La metodología de superficie de respuesta (RSM) y las redes neuronales artificiales (ANNs) constituyen técnicas de optimización interesantes, que han sido exitosamente aplicadas en los sistemas de producción de proteínas recombinantes. El objetivo de este trabajo fue optimizar la composición de un medio de cultivo para E. coli recombinante aplicando RSM y ANNs, para maximizar la producción y reducir costos, aplicable a procesos batch de escala laboratorio y semi-industrial. La proteína recombinante seleccionada es una hemoglobina (Hb) no simbiótica de Oryza sativa, la cual posee un color rojo característico que permite una sencilla cuantificación espectrofotométrica, constituyendo un buen modelo experimental.  Metodología Se empleó la cepa E. coli BL21 (DE3) transformada con la construcción [pET28/OsHb1]. La misma fue mantenida en medio LB agar, a 4 °C durante lapsos inferiores a 30 días. Se realizaron inicialmente 18 experimentos que consistieron en cultivos en diferentes formulaciones de medios. Tales formulaciones surgieron de la aplicación de un diseño central compuesto, en el que se variaron las concentraciones de triptona (TT), extracto de levadura (EL), cloruro de sodio (NaCl) y glicerol de desecho (GD). Los rangos de concentración evaluados (g L-1) fueron: 10–50; 5–50; 1–20 y 0,25–2,5; respectivamente para cada ingrediente. De cada medio se dispensó un volumen de 30 mL en frascos Erlenmeyer y una vez esterilizados y enfriados, se suplementaron con sulfato de kanamicina (10 g L-1). Posteriormente se inoculó con una alícuota de un cultivo de la cepa, en c.s.p.: 0,1 unidades ópticas (600 nm). El cultivo inóculo se desarrolló durante 24 h en medio LB, suplementado con aquel antibiótico, contenido en frascos Erlenmeyer. Todas las incubaciones se realizaron a 30 °C, con agitación orbital (200 rpm). Como control se realizaron cultivos en medio LB. Cuando los cultivos alcanzaron 1,0 unidad óptica (600 nm), se procedió a inducir la síntesis proteica dispensando 0,3 mL de una solución de lactosa (250 g L-1). A las 24 h pos-inoculación, se procedió a cosechar cada cultivo separando la biomasa mediante centrifugación, la que se cuantificó gravimétricamente (respuesta 1: concentración de biomasa –BM-). Posteriormente, se resuspendió en una solución de extracción y se lisó mediante ultrasonido. El sobrenadante de este procedimiento, obtenido mediante centrifugación, se empleó para determinar espectrofotométricamente (410 nm) la concentración de Hb (respuesta 2: concentración de Hb). Como testigo se empleó una solución patrón de la misma Hb obtenida en el laboratorio y valorada mediante densitometría.  Resultados y conclusiones Los datos obtenidos se ingresaron al diseño experimental y se analizaron con la ayuda de programas informáticos. Aplicando RSM, la respuesta BM se ajustó con un modelo lineal con un coeficiente de determinación (R2) de 0,654; mientras que para la respuesta Hb se ajustó un modelo cuadrático que presento un R2 de 0,876. En una etapa posterior, aplicando la función deseabilidad global y con el propósito de minimizar la concentración de biomasa y de maximizar la de Hb, se obtuvo la siguiente combinación óptima (medio R1) (en g L-1): TT: 29,71; EL: 23,90; NaCl: 1,00; GD: 0,25. En la Tabla 1 se muestran los valores predichos para ambas respuestas. En una segunda etapa, los datos se analizaron aplicando ANNs con el fin de mejorar los estadísticos obtenidos aplicando RSM. De este análisis, resultaron valores de 0,922 y 0,970 para los coeficientes de determinación de BM y Hb, respectivamente. Al aplicar la función deseabilidad global teniendo en cuenta los mismos criterios de optimización empleados para el caso de RSM, se obtuvo una formulación óptima que se denominó medio A1. Su composición (en g L-1) fue: TT: 42,69; EL: 20,11; NaCl: 17,77; GD: 0,33. Los valores predichos para las respuestas BM y Hb se muestran en la Tabla 1. Los medios R1 y A1 fueron verificados experimentalmente. Los resultados se muestran en la Tabla 1. Tabla 1: valores predichos y experimentales Metodología Medio de cultivo Respuesta Tipo BM (g L-1) Hb (g L-1) RSM R1 Predicha 22,21 3,15 Experimental 21,56 2,44 ANNs A1 Predicha 19,24 3,59 Experimental 18,48 3,50 En ambos medios de cultivo pudo verificarse el consumo completo de glicerol. Los datos empíricos sólo mostraron concordancia con lo predicho aplicando ANNs, por lo que el empleo del medio A1 permite maximizar la concentración de Hb y minimizar la de biomasa. Conforme a datos suministrados por proveedores locales de insumos, los costo por litro de los medios LB y A1 son de U$S 8,3 y U$S 30,9; respectivamente. Si bien el medio A1 es 370 % más caro que el medio LB, la concentración de Hb aumenta en un 480 % (3,5 g L-1 contra 0,73 g L-1). De esta manera, producir 1 g de proteína recombinante en el medio LB costaría U$S 43,3 contra U$S 32,8 en el medio A1. Además, se incrementó en un 320 % la productividad específica por biomasa (0,057 en medio LB contra 0,180 en medio A1), resultado que incide positivamente en el rendimiento global del bioproceso, en cuanto a productividades volumétricas de biorreactor y a reducción de los efluentes. En conclusión, mediante la aplicación de herramientas quimiométricas fue posible optimizar un medio de cultivo para E. coli recombinante, sobre la base del rendimiento y costo. Además, los resultados permiten explorar alternativas para la valorización del glicerol crudo, subproducto de los procesos de producción de biodiesel.