Estudio del gen ospB en Escherichia coli enterohemorrágica O157:H7

WANDERSON MARQUES DA SILVA; MARIANO LARZABAL; A CATALDI

Congreso; IV Congreso Argentino de Microbiología Agrícola y Ambiental; 2018

Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC) O157:H7 es un patógeno zoonótico responsable del síndrome urémico hemolítico en humanos. A través de análisis in silico del genoma de la cepa EHEC O157:H7 Rafaela II clado 8, aislada de un bovino en Argentina, nuestro grupo identificó en el bacteriófago 2851 una ORF que codificaba una proteína con similitud a la proteína OspB del patógeno Shigella flexneri. En S. flexneri, OspB es secretado por el SST3 y está involucrado en la modulación del sistema inmune. Por otro lado en EHEC, aún no se sabe si OspB es secretado por el SST3 y cuál sería su rol en la virulencia de este patógeno. El presente trabajo tiene como objetivo caracterizar el gene OspB y evaluar su importancia en la patogénesis de EHEC. Las bacterias fueron cultivadas en los medios Luria-Bertani (LB) y Dulbecco´s Modified Eagle Medium (D-MEM) a 37 ºC. En el caso de los ensayos de expresión fue adicionado 1 mM de IPTG y 100 µg/mL de ampicilina. Las mutagénesis de los genes ospB y escN fueron generadas por recombinación homóloga utilizando el sistema lamba red de Datsenko y Wanner. Las mutantes fueron complementadas con el gen ospB clonado en el plásmido pLF-3xFLAG (pOspB). Para el análisis de proteínas secretadas, los sobrenadantes de cultivos fueron filtrados, precipitados y analizados por Western blotting. El análisis in silico de alineamientos múltiples de aminoácidos reveló que OspB de EHEC Rafaela II presenta 32% de identidad con OspB de otros patógenos como: S. flexneri, S. dysenteriae, Salmonella paratyphi y Vibrio parahemolyticus. Las curvas de crecimiento revelaron que las cepas Wt y ∆ospB presentan el mismo perfil de crecimiento y viabilidad cuando se cultivaron en los medios LB y D-MEM. Para evaluar si OspB podría ser secretada por SST3 de EHEC, se realizó un ensayo de secreción. Se generó una cepa mutante para el gen escN que codifica para una ATPasa citoplasmática que es necesaria para la translocación funcional del SST3. Las cepas Wt y las cepas mutantes complementadas ∆ospB/pOspB y ∆escN/pOspB fueron cultivadas en medio D-MEM y las proteínas fueron analizadas por Western blotting utilizando un anticuerpo anti-FlagM2. OspB fue detectado tanto en el pellet bacteriano de ∆ospB/pOspB como en el pellet de ∆escN/pOspB. Sin embargo, OspB fue detectada sólo en el sobrenadante de la cepa ∆ospB/pOspB. Con los resultados obtenidos hasta el presente, hemos demostrado que así como en S. flexneri, OspB de EHEC Rafaela II es secretada por el SST3.