Nuevo efector NleB2-1 secretado de manera dependiente por el Sistema de secreción de tipo III de Escherichia coli enterohemorrágica O157:H7

BRENDA BUSSACA; ANGEL A. CATALDI; LARZABAL MARIANO

Rosario

Congreso; Congreso Latinoamericano y argentino de microbiología 2016; 2016

AAM

El efector NleB (non-LEE-encoded B) está altamente conservado en cepas de Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC) y su expresión está asociada subsecuentemente con el desarrollo de síndrome urémico hemolítico (SUH) durante los brotes provocados en humanos. Estudios recientes demostraron que NleB es secretado por el sistema de secreción de tipo III (SST3) y modula la respuesta inmune innata del hospedador reprimiendo la transcripción del factor NF-kB. Trabajos recientes han identificado bioinformaticamente más de 60 genes efectores predichos a ser secretados por el SST3 de EHEC O157:H7, entre ellos se ha encontrado que el gen ECs0846 (nleB2-1) presenta homología con los efectores de la familia NleB pero aún no ha sido caracterizado in vitro como efector.ObjetivoEl objetivo de nuestra investigación consiste en demostrar que la proteína NleB2-1, predicha como factor de virulencia, es secretada de manera dependiente por el SST3 de EHEC O157:H7.Materiales y métodosEl gen nleB2-1 (981 bp) fue clonado en el vector pGEM-T y luego subclonado en el vector de expresión pLF-3xFLAG. Se expresó NleB2-1 de forma recombinante como producto de fusión a la etiqueta FLAG en cepas EHEC O157:H7. Se realizaron ensayos de secreción in vitro para la cepa EHEC O157:H7 EDL933 pLF-3xFLAG-nleb2-1 para determinar la presencia de NleB2-1 por western blot.ResultadosHemos analizado el gen candidato por estudios bioinformáticos a través de software Effective T3 que proporcionan predicciones sobre efectores secretados por SST3 utilizando datos de secuencias de proteínas candidatas públicamente. La proteína NleB2-1 obtuvo un score de 1, indicando que posee homología con otros efectores ya secretados. Se realizaron ensayos de secreción in vitro para la cepa EHEC O157:H7 EDL933 pLF-3xFLAG-nleb2-1 en presencia de IPTG para inducir la expresión de la proteína recombinante. Para determinar la presencia de NleB2-1 se precipitaron las proteínas del sobrenadante de cultivo y se realizaron ensayos de western blot utilizando anticuerpos monoclonales específicos anti el epítope FLAG. La presencia del efector NleB2-1 en sobrenadantes de cultivo indicaría que está siendo reconocido y secretado de manera dependiente por el SST3 de EHEC O157:H7 EDL933.