Clonado y expresión heteróloga funcional de fosfolipasa A2 de Bothrops diporus (Yarará chica): inicio de estudio de relación estructura-actividad

PABLO J. YUNES QUARTINO, JOSÉ L. BARRA, GERARDO D. FIDELIO

Ciudad de La Plata

Congreso; XXXVII Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Biofisica; 2008

Sociedad Argentina de Biofísica

Relación estructura:actividad de fosfolipasas: clonado y expresión heteróloga funcional de fosfolipasa A2 de Bothrops diporus (Yarará chica)Pablo J. Yunes Quartino, José L. Barra y Gerardo D. FidelioDepartamento de Química Biológica-CIQUIBIC, Universidad de Nacional de Córdoba, Haya de la Torre S/N, X5000HUA, Córdoba, Argentinae-mail: pabloyunes@mail.fcq.unc.edu.arEl veneno de víboras de la familia viperidae es una mezcla compleja de miotoxinas y enzimas hidrolíticas, en la cual se haya presente invariablemente la enzima secretoria fosfolipasa A2 tipo II (PLA2s). Numerosas isoespecies de PLA2s han sido identificadas en distintas especies de ofidios e incluso en distintos ejemplares dentro de una misma especie. Aunque existen numerosos estudios relacionados a los efectos in vivo de distintas PLA2s, estudios biofísicos comparativos tendientes a dilucidar la relación estructura-función de distintas isoespecies son más bien escasos.La víbora Bothrops diporus (yarará chica) es la responsable de más del 80% de los accidentes con ofidios en la república Argentina. Por trabajos previos de nuestro laboratorio se identificaron tres isoespecies de PLA2s (denominadas P1, P2, P3) a partir de veneno de esta víbora. Estudios de actividad enzimática en monocapas, utilizando como sustrato dilaurilfosfatidilcolina (dlPC), mostraron que la isoespecie P3 presenta una presión lateral óptima de actividad lipolítica notablemente mayor que las otras dos isoespecies [1]. Las causas de estas diferencias son hasta el momento desconocidas.A fin de investigar la posible correlación entre secuencia, conformación y actividad hidrolítica se dispuso clonar isoespecies de PLA2 de yarará chica y caracterizar su comportamiento enzimático en interfases.Para ello se obtuvo ADNc a partir de ARNm extraído de glándula de veneno y a partir de oligonucleótidos diseñados sobre secuencias de otras especies, se amplificó por PCR un fragmento que fue subclonado en vector de amplificación bacteriano y secuenciado. De esta secuencia se dedujo la composición de aminoácidos de la proteína, observándose que  la especie clonada correspondería a una nueva isoespecie. Posteriormente se hizo una construcción para producir dicha proteína en E. coli, obteniéndose buenos niveles de expresión. Posteriormente, la proteína fue purificada a partir de cuerpos de inclusión y renaturalizada en condiciones nativas. Finalmente, se comenzaron estudios enzimáticos en vesículas multilamelares de lecitina de soja y en monocapas de dlPC. Resultados preliminares indican que la isoespecie purificada presentó actividad lipolítica dependiente de Ca2+ con una presión lateral óptima mayor a la enzima pancreática bovina utilizada como control. Los resultados son discutidos en relación a datos disponibles para otras isoespecies.Referencias[1]  J. J. DANIELE, I. D. BIANCO, C. DELGADO, D. BRIONES CARRILLO y G. D. FIDELIO. Toxicon,  1997, (35) 8, 1205-1215Agradecimientos: Al Dr. Gerardo Leynaud, Centro de Zoología Aplicada, Facultad de Ciencias Exactas Físicas y Naturales, Universidad Nacional de Córdoba, por su asistencia en el manejo experimental de víboras.Este trabajo fue financiado en parte con fondos de SeCyT-UNC, Agencia Córdoba Ciencia, CONICET y FONCYT.