CONICET | Buscador de Institutos y Recursos Humanos

ResumenSe propone expresar el dominio III consenso de la proteína E del virus del dengue fusionada a hidrofobina utilizando el sistema de baculovirus y como huésped de expresión células (Sf9) y larvas de insecto, de las especies Rachiplusia nu y Spodoptera frugiperda. La proteína recombinante obtenida en ambos sistemas, se purificó mediante un sistema de dos fases acuosas, obteniendo la proteína parcialmente purificada. Evaluando los diferentes huéspedes, se obtuvo una mayor producción de proteína con Rachiplusia nu.Palabras claveDominioIII; dengue; baculovirus; dos fases acuosas1.Introducción El virus del dengue pertenece a la familia Flaviviridae y presenta cuatro serotipos antigénicamente diferentes. Es un virus de RNA simple cadena y su genoma codifica para una poliproteína que tras su clivado da origen a tres proteínas estructurales cápside (C), membrana (M) y envoltura (E); y a siete proteínas no estructurales. La proteína E posee tres dominios, el dominio III (DomIII) contiene múltiples epítopes neutralizantes que son serotipo-específicos. Este dominio es más fácil de producir en sistemas recombinantes por su menor tamaño y, además, carece de otros epitopes que desencadenan anticuerpos no neutralizantes de reactividad cruzada.Recientemente ha sido descripta una secuencia consenso del DomIII, basándose en el DomIII de la proteína E de distintas variedades de cada serotipo de todo el mundo, la cual demostró capacidad de generar una respuesta inmune contra todos los serotipos.Las hidrofobinas son proteínas anfifílicas de entre 7.5 ? 10 kDa, producidas por hongos filamentosos. Se ha observado que las proteínas fusionadas a ellas ven alteradas su hidrofobicidad y pueden ser separadas fácilmente en sistemas de dos fases acuosas (ATPS), principalmente en aquellos basados en surfactantes no-iónicos.El objetivo de este trabajo es expresar en células y larvas de insectos la secuencia consenso del Dom III fusionada a hidrofobina (DomIIIcHFB) y purificarla en un sistema de dos fases acuosas, con el fin último de desarrollar un kit diagnóstico. 2.Metodología Mediante síntesis química (Genscrip), se obtuvo la secuencia Dom III consenso fusionada a hidrofobina. La secuencia fue clonada en el vector de transferencia pAcGP67-B, que contiene el péptido señal de la glicoproteína acídica gp67 para la secreción de las proteínas al medio extracelular, bajo el promotor fuerte de poliedrina viral. Por cotransfección con el ADN viral BaculoGoldTM Bright (Pharmingen) se obtuvo el baculovirus recombinantes en la línea celular Sf9. El baculovirus recombinante fue amplificado para obtener stocks viral de alto título y titulado por la técnica del punto final.Se infectaron cultivos de células Sf9 con el baculovirus recombinante, probando distintas multiplicidad de infección (moi 0.5 y 2) y se evaluó la cinética de expresión en el medio de cultivo.Con la intención de realizar un escalado de este sistema, se infectaron larvas de insectos de la especies Rachiplusia nu y Spodoptera frugiperda con el baculovirus recombinante. Las larvas se cosecharon al presentar fluorescencia bajo lámpara UV al tercer día post infección (dpi). Para la extracción de las proteínas se homogeneizaron las larvas en un mortero agregando 1 ml de buffer PBS por larva. Sobre los sobrenadantes de las células de insecto y los extractos de larvas, se llevó a cabo la purificación mediante dos fases acuosas. Para ello, a la muestras se les agregó Triton X-114 a una concentración del 4%. Luego de la separación de fases, a la fase con detergente se le agrego isobutanol para recuperar la proteína. Luego de esta segunda separación de fases, se obtuvo una segunda fase acuosa donde se espera que se encuentre la proteína purificada. En esta separación de fases se formó una interfase, que fue recuperada para su análisis. Las muestras se analizaron por SDS-Page y Western Blot, utilizando un suero de conejo policlonal anti-Dengue (Ab9200, Abcam).3.Resultados y DiscusiónSe obtuvieron los vectores de transferencia y con ellos los baculovirus recombinantes para la expresión del DomIIIcHFB en larvas y en células de insecto. En lo que respecta a células de insectos, utilizando una moi de 0.5 se observó la presencia de la proteína, mediante Western blot, a partir del tercer día post infección y una banda de mayor intensidad al cuarto día. Al infectar las células con una moi de 2 se observó la presencia de la proteína a partir del segundo día, siendo más intensa en el tercer día. Al realizar la purificación mediante dos fases acuosas, la proteína se encontró en la segunda fase acuosa y asimismo en la interfase que se formó en ambos casos. En lo que respecta a la infección de larvas, se observó por Western blot la expresión tanto en larvas de Rachiplusia nu como de la especie Spodoptera frugiperda. Al realizar la purificación mediante dos fases acuosas, se logró observar en el SDS- PAGE para ambas especies, una banda que se corresponde con el peso molecular de la proteína, en la muestra que corresponden a la interfase. Esta banda fue confirmada por el Western blot. Se observó una banda de mayor intensidad en la interfase que se forma en la muestra de Rachiplusia nu. 4.Conclusiones Se logró expresar la proteína recombinante exitosamente tanto en larvas como en células de insecto, mediante el sistema de baculovirus. La proteína fue purificada parcialmente por ATPS utilizando Tritón X-114 al 4%. Dado que la mayor cantidad de proteína se obtuvo con larvas Rachiplusia nu, y además, el costo es menor que con células de insectos, se continuará trabajando con este sistema. 5.BibliografíaLeng, CH, et al. (2009) A novel dengue vaccine candidate that induces cross-neutralizing antibodies and memory immunity. Microbes Infect 11,288?95.Lindenbach Brett D., et al. (2013) Flaviviridae. En: Knipe DM, Howley PM, eds. Fields Virology. 6º ed. Vol. I. Filadelfia, 712-746.EJE TEMATICO: Procesos de recuperación y purificación de macromoléculas

enviar mensaje