PRODUCCIÓN DE UN NUEVO INTERFERÓN RECOMBINANTE VETERINARIO EN LARVAS DE INSECTO

MARIANA B. ARREGUI; GREGORIO MC CALLUM; MARCELA SOLANGE VILLAVERDE; ALEXANDRA M. TARGOVNIK; MARÍA V. MIRANDA

ciudad de buenos aires

Congreso; XII Congreso Argentino de Virología; 2017

Sociedad Argentina de Virología

Introducción. En veterinaria, las citoquinas se administran para reducir la mortalidad y los signos clínicos de ciertas infecciones virales como la parvovirosis canina o la leucemia felina viral felina viral. El interferón beta felino (fIFNβ) es una citoquina secretada por células en respuesta a infecciones virales, así como a otros microorganismos y sus componentes. El fIFNβ induce efectos antivirales, antitumorales, antiparasitarios e inmunomoduladores y no se produce comercialmente. Con el fin de generar un nuevo biofármaco para la industria veterinaria local, desarrollamos en este trabajo un método biotecnológico para la expresión y purificación de fIFNβ recombinante, en el sistema baculovirus-larvas de insecto. Metodología. Se construyó un baculovirus recombinante (Autographa californica -AcMNPV), conteniendo el gen sintético de fIFNβ bajo el promotor de poliedrina y la secuencia señal viral gp67, y el gen de la Proteína Verde Fluorescente (GFP) bajo un promotor temprano usado como marcador. Tras la amplificación del mismo, se obtuvo un stock viral de alto título que se utilizó para la infección de larvas de Spodoptera frugiperda. Al cuarto día post-infección se cosecharon las larvas que se mostraban fluorescentes bajo luz UV y se obtuvo un extracto por homogeneización y clarificación. La purificación del fIFNβ recombinante se realizó por cromatografía de Blue-Sepharose a pH 7,2. Se realizaron lavados con NaCl 0,5 M y se eluyó la proteína con NaCl 1M. Se determinó la actividad antitumoral en células de carcinoma mamario felino y se realizó un ensayo de inhibición del efecto citotóxico del Virus de Estomatitis Vesicular (VSV) sobre fibroblastos de gato (actividad antiviral). Además, en el producto final se analizó la presencia de DNA viral por PCR y geles de agarosa al 1%. Resultados. Se obtuvieron 5,3x104 UI de fIFNβ por larva. La proteína presentó un peso molecular de 23 kDa, que corresponde con la correcta glicosilación de la misma. Se purificó en un único paso cromatogáfico a partir del homogenato de larvas. Mediante Western Blot se evidenció la elución del fIFNβ en la fracción de NaCl 1M y según SDS-PAGE en las condiciones del ensayo la mayoría de las proteínas contaminantes (>95%) no se adsorbieron a la matriz. Finalmente, el fIFNβ puro no presenta contaminación con proteínas inmunogénicas de la larva, según el ensayo de Western Blot con anticuerpos policlonales para proteínas nativas de S. frugiperda, ni tampoco con DNA viral. El fIFNβ presentó una alta actividad biológica: antiviral de 7x104 UI/mL, comparable con el fIFNω comercial (Virbagen Omega, Virbac), y el doble de actividad antitumoral que éste. El mismo efecto antitumoral se logra con 5x103 UI fIFNβ o 1x104 UI fIFNω. Conclusiones. Los resultados de este trabajo sientan las bases para el desarrollo de un proceso biotecnológico original basado en larvas de insecto para la producción de un nuevo biofármaco para uso veterinario, eficiente y de bajo costo.