EXPRESIÓN DEL ECTODOMINIO DE LA GLICOPROTEÍNA DEL VIRUS DE LA RABIA EN INSECTOS PARA SU APLICACIÓN CON FINES DIAGNÓSTICOS

ALEXANDRA M. TARGOVNIK; GREGORIO MC CALLUM; MARIANA B. ARREGUI; MATÍAS MICUCCI; OSCAR PEREZ; ALEJANDRO FERRARI; OSVALDO CASCONE; MARÍA VICTORIA MIRANDA

ciudad de buenos aires

Congreso; XII Congreso Argentino de Virología; 2017

Sociedad Argentina de Virología

El virus de la rabia (RABV), es el agente etiológico de una enfermedad infecto-contagiosa que constituye una de las principales zoonosis con distribución mundial. La Glicoproteína G (RABV-G) es una de las principales proteínas estructurales pertenecientes al virión que es la responsable de la adsorción específica del virus a la membrana de la célula. El estado de protección frente a la infección y la potencia de nuevas vacunas pueden valorarse determinando el nivel de anticuerpos séricos neutralizantes inducidos por la RABV-G en individuos vacunados. Para conocer dicho valor se puede utilizar un enzimoinmunoensayo que es importado en nuestro país y que para su formulación se debe trabajar con virus activo lo que genera riesgos biológicos en la producción. Es posible obtener este insumo a través de métodos biotecnológicos aplicando tecnología de ADN recombinante. En el sistema baculovirus, la producción de proteínas puede lograrse infectando cultivos de líneas celulares comerciales o bien empleando larvas de lepidóptero. El objetivo de este trabajo fue expresar la RABV-G en células de insecto para su posterior escalado en larvas autóctonas de Argentina para su aplicación con fines diagnósticos. Metodología: Se construyó un vector de transferencia clonando la secuencia que corresponde a la región del ectodominio de la RABV-G, fusionado a una etiqueta de 6 histidinas en su extremo carboxilo, en el plásmido pAcGP67-B. Por cotransfección de este vector con el ADN viral BaculoGoldTM Bright (Pharmingen) en la línea celular Sf9 se obtuvieron los baculovirus recombinantes Se infectaron cultivos de células Sf9 y se evaluó la cinética de expresión a diferentes multiplicidades de infección (MOI 0,05; 0,5 y 5). Posteriormente se estudió la purificación de la proteína por cromatografía de iones metálicos inmovilizados (IMAC). Además, se llevó a cabo la expresión de la proteína recombinante en larvas de Spodoptera frugiperda. Resultados: En la línea celular Sf9 se determinó que la proteína quedó retenida dentro de la célula y la presencia del detergente NP-40 fue determinante en la extracción de la misma. En este sistema las condiciones óptimas de expresión fueron infección a MOI 0,5 y cosecha a los 3 días postinfección. Se obtuvo una proteína homogénea con peso molecular aproximado de 50 kDa que se purificó en un solo paso. Por otro lado, cuando la proteína fue expresada directamente en larvas no fue secretada a la hemolinfa y se logró su recuperación con un buffer conteniendo NP-40, DMSO y EDTA combinado con un paso de sonicado. Se obtuvo dos isoformas de la proteína con pesos cercanos a 50 kDa. Conclusión: Los resultados expuestos en el presente trabajo indican que el sistema de expresión baculovirus resulta adecuado para la producción de RABV-G tanto en líneas celulares como larvas de insecto y la proteína antigénica purificada puede aplicarse a la fabricación de reactivos de diagnóstico.