CARACTERIZACIÓN FISICOQUÍMICA DE LOS CONTAMINANTES PROTEICOS DE LARVA DE INSECTO, UTILIZANDO BACULOVIRUS RECOMBINANTES PARA LA PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS

GREGORIO MC CALLUM; MARIANA B. ARREGUI; ALEXANDRA M. TARGOVNIK; MARÍA V. MIRANDA

ciudad de buenos aires

Congreso; XII Congreso Argentino de Virología; 2017

Sociedad Argentina de Virología

El uso de baculovirus como vector de expresión para la producción de proteínas recombinantes ha crecido sustancialmente en los últimos años. La utilización de líneas celulares de insecto implica la necesidad de ambientes asépticos, material estéril, biorreactores y medios de cultivos de alto costo. La utilización directa de larvas de insectos infectadas con baculovirus recombinantes constituye una excelente alternativa con altos niveles de producto y sin necesidad de los requerimientos antes mencionados lo que reduce los costos al menos 100 veces, limitada únicamente por la compleja purificación. El objetivo de este trabajo fue estudiar los contaminantes presentes en el sistema, su comportamiento cromatográfico y sus características fisicoquímicas para poder elaborar algoritmos racionales de purificación a gran escala basados en este conocimiento.Se construyeron diferentes baculovirus recombinantes basados en Autographa californica para la expresión de proteínas de distinta naturaleza y de interés comercial.Las larvas fueron criadas por 4 días en ambiente controlado y alimentadas a base de una dieta artificial. Los homogenatos obtenidos fueron clarificados y purificados por cromatografía utilizando matrices de intercambio iónico e interacción hidrofóbica y luego los eluatos analizados mediante electroforesis bidimensional e interpretados informáticamente. También se analizó el patrón 2D del total de proteínas presentes en larvas de R. nu infectadas y no infectadas.Se observó un menor número total de proteínas detectables en larvas infectadas en comparación con larvas sin infectar. Utilizando matrices cromatográficas de intercambio catiónico, el número de spots detectados fue muy escaso lo que significaría una ventana de trabajo donde es posible purificar proteínas recombinantes de alto punto isoeléctrico. En contraste, las matrices de intercambio de aniones adsorben una gran cantidad de proteínas del huésped.Al estudiar cromatografías de interacción hidrofóbica se detectó la presencia de proteínas de pI cercanos a 7 y una predominancia de proteínas de bajo PM.Para validar estos resultados, se purificó peroxidasa de rábano picante recombinante producida en larvas de R. nu unida a una etiqueta de argininas para modificar su punto isoeléctrico de 7,0 a 9,5. El extracto larval fue purificado mediante matrices de CM-Sepharose y de SP-Sepharose, obteniéndose en este último un elevado grado de pureza.En conclusión, con el estudio del comportamiento cromatográfico y la caracterización fisicoquímica de los contaminantes del sistema, se profundiza el conocimiento de esta nueva plataforma, lo que permitirá diseñar y optimizar procesos de purificación racionales. El predominio de proteínas ácidas en el huésped, nos permitirá la purificación de proteínas recombinantes con alto punto isoeléctrico (o con una etiqueta de residuos de argininas) mediante cromatografías de intercambio de cationes (CM y SP-sepharose) de una manera sencilla.