Nueva plataforma biotecnológica para la producción de proteínas de interés en medicina veterinaria y en diagnóstico

GREGORIO MC CALLUM; MARIANA B. ARREGUI; ALEXANDRA MARISA TARGOVNIK; MARÍA VICTORIA MIRANDA

Ciudad de buenos aires

Congreso; 10mo Congreso y Exposición para la Ciencia y Tecnología Farmacéutica, Tecnología, Veterinaria y Cosmética; 2016

La expresión de proteínas recombinantes utilizando larvasde insectos infectadas con baculovirus constituye una interesantealternativa biotecnológica debido a los altos nivelesde producto que se alcanzan. Sin embargo, la utilizaciónde insectos como biofábricas no es una plataforma ampliamenteexplotada en la actualidad y uno de los motivos esla complejidad de la purificación de las proteínas a partirde los extractos larvales. En contraposición, en Europaestá aprobada la comercialización para uso veterinariodel interferón omega felino producido en gusano de seda.Con el objeto de contribuir con la producción nacional deproteínas recombinantes, en nuestro laboratorio estamosestudiando en profundidad una nueva plataforma biotecnológicade bajo costo basada en la utilización de larvasde insectos lepidópteros autóctonos de Sudamérica, específicamenteRachiplusia nu, la cual presenta la ventajade ser susceptible a la infección por vía oral, facilitando ydisminuyendo los tiempos de producción.Metodología:Hemos construido diferentes baculovirus recombinantesbasados en AutographaCalifornica (rAcMNPV) para la expresiónde péptidos antimicrobianos, lectinas, citoquinas,enzimas para diagnóstico, proteínas virales antigénicaspara uso en diagnóstico y en vacunas.Se estudió en todos los casos las cinéticas de expresiónpara la selección del día de cosecha y se optimizó un procesopara la recuperación de las proteínas recombinantesa partir de extractos larvales. Se analizaron las características fisicoquímicas (tamaño,carga superficial) de las proteínas del huésped en geles 2Dpara establecer protocolos generales para la purificaciónde las proteínas de interés.Resultados:Los insectos criados en el laboratorio se infectan vía intrahemocelecon rAcMNPV cuando alcanzan el 5º estadiolarval con un peso aproximado de 250 mg. Los niveles deexpresión fueron variables entre 25 - 100 μg/larva R. nu(peroxidasa de rábano picante, aglutinina de germen detrigo, interferón omega felino) y de 0,3 - 1 mg/larva (neuraminidasadel virus gripe A, proteína del virus del dengue).La cosecha se realizó al 3º día post infección.Los estudios realizados de las proteínas propias del huéspeddemostraron que frente a la infección viral cambia elperfil proteico. Según los resultados en geles 2D, el númerode spots de larvas no infectadas es de 95 mientras que enlas infectadas es de 43. Por Western Blot se detectaron59 proteínas inmunogénicas en la larva no infectada y solamente40 en la infectada evidenciando un silenciamientoy redireccionamiento de la maquinaria celular de larvas delinsecto frente a la infección viral.Los puntos isoeléctricos de las proteínas de las larvas infectadasse ubicaron alrededor de todo el gradiente de pH(3-10) siendo las acídicas las más abundantes. Se observóuna mayor densidad de proteínas en pesos molecularessuperiores a 20 kDa en larvas no infectadas y en el rangode 10-40 kDa para las infectadas.