Infección oral de larvas de lepidópteros con baculovirus para expresión de peroxidasa

LUCÍA V. ROMERO; ALEXANDRA M. TARGOVNIK; GUSTAVO J. LEVIN; OSVALDO CASCONE; MARÍA V. MIRANDA

Paseo la Plaza, Buenos Aires, Argentina.

Congreso; IX Congreso Argentino de Virología.; 2008

Sociedad Argentina de Virología

El sistema baculovirus/células de insecto es ampliamente utilizado para expresar proteínas recombinantes de interés tanto en la industria biotecnológica como farmacéutica, debido a su manejo seguro y a su naturaleza eucariota. La mayoría de los baculovirus son construídos reemplazando el gen de poliedrina por el de interés para aprovechar la fuerza del promotor. Este tipo de virus con fenotipo occ- es incapaz de generar poliedros resultando ineficiente para infectar larvas de lepidópteros por vía oral. Las metodologías clásicas de infección son vía oral con poliedros e inyección intrahemocélica de virus brotados (occ-). La primera resulta ser más adecuada para realizar infecciones masivas de insectos. De esta manera, las larvas pueden ser utilizadas como “bio-fábricas” para producir proteínas recombinantes a bajo costo en comparación con el proceso en cultivo celular. La peroxidasa  (HRPC), un importante biocatalizador comercial cuya complejidad estructural dificulta su expresión en sistemas procariotas, fue utilizada como proteína modelo. Nuestro objetivo fue el desarrollo de un proceso de producción de HRPC recombinante en larvas de insecto infectadas oralmente con baculovirus occ+ como vectores de expresión.  Las estrategias fueron: 1) Obtención de poliedros mixtos mediante co-infección de cultivos celulares con virus salvaje AcMNPV y recombinante AcMNPV HRPC+/occ- a distintas multiplicidades de infección virus salvaje:recombinante (MOIs:r). Al día 4 post-infección (dpi) dichos poliedros fueron purificados, cuantificados y luego caracterizados por PCR en Tiempo Real; 2) Construcción de AcMNPV HRPC+/occ+ mediante recombinación homóloga en células de insecto entre el vector de transferencia pAcGP67 con HRPC bajo promotor de poliedrina y el bácmido GOZA, genoma viral completo donde el gen de poliedrina se encuentra bajo control del promotor p10. Larvas de Rachiplusia nu y Spodoptera frugiperda fueron alimentadas con dieta contaminada con 1 x 106 poliedros mixtos o poliedros AcMNPV HRPC+/occ+. A los 4 y 8 dpi respectivamente se colectó la hemolinfa y se determinó la actividad de HRPC. La producción de poliedros mixtos resultó ser una herramienta efectiva para infectar larvas vía oral con un virus occ-. Cuando fueron usados como inóculo para infectar larvas de R. nu, la máxima actividad de HRPC se logró con los poliedros mixtos MOIs:r 2:10 y 2:20. Por otro lado, se construyó un baculovirus HRPC+/occ+ con capacidad para expresar HRPC y generar poliedros. Al infectar larvas de R. nu, la actividad enzimática fue significativamente mayor – 120,5 ± 15,5 U ml-1 (47,5 ± 6,5 mg l-1) - que la obtenida con poliedros mixtos MOIs:r 2:10 y 2:20 – 78,5 ± 10,3 U ml-1 (31,1 ± 4,5 mg l-1) y 40,3 ± 20,2 U ml-1 (16,2 ± 8,4 mg l-1), respectivamente – (P < 0,05). Además, AcMNPV HRPC+/occ+ representa una estrategia más sencilla y rápida para generar poliedros con el objeto de producir HRPC en lotes numerosos de larvas. La limitación de los poliedros mixtos es la necesidad de co-infectar cultivos cada vez que éstos deben ser utilizados como inóculo, lo que representa un cuello de botella a la hora de producir HRPC. Cuando se infectaron larvas de S. frugiperda con poliedros AcMNPV HRPC+/occ+, la actividad alcanzada fue sólo de 0,9 ± 0,2 U ml-1. Según los resultados obtenidos, la opción más adecuada para producir altos niveles de HRPC es la infección por vía oral de larvas de R. nu con poliedros de AcMNPV HRPC+/occ+ debido al rendimiento de expresión alcanzado y por la practicidad en cuanto a la generación de poliedros.