Modificación de punto isoeléctrico de Interferón Felino recombinante para su purificación directa por cromatografía de intercambio iónico

ALEXANDRA M. TARGOVNIK; OSCAR TABOGA; OSVALDO CASCONE; MARÍA V. MIRANDA

Buenos Aires

Congreso; X Congreso Argentino de Virología; 2011

Sociedad Argentina de Virología

El Interferón felino (FeIFN) es una proteína glicosilada de 171 aminoácidos con un punto isoeléctrico (PI) de 6,5. Se ha demostrado que la aplicación en gatos de FeIFN recombinante (rFeIFN) mejora la sintomatología y prolonga la supervivencia de estos animales infectados con diversos virus felinos siendo más efectivo a largo plazo que el tratamiento con interferón alfa humano. El rFeIFN no se produce ni comercializa en nuestro país.El objetivo de este trabajo fue expresar rFeIFN de alto PI en el sistema baculovirus-células de insectos para facilitar su purificación por cromatografía de intercambio iónico.El gen sintético de rFeIFN se clonó en un vector de transferencia bajo el promotor de poliedrina y el péptido señal viral GP67. Además se agregó en el extremo 3’ del gen una secuencia que codifica para 8 residuos de arginina. Se obtuvieron los baculovirus recombinantes por contrasfección del plásmido de transferencia y el ADN viral BaculoGoldTM Brigth en células de insecto Sf9 cultivadas en medio Sf900 II suplementado con 1% de suero fetal bovino. El título viral se amplificó en sucesivos pasajes hasta obtener un stock de trabajo de 1 x 108 ufp/ml. El rFeIFN8xarg se cosechó el día 4 postinfección a partir del sobrenadante de cultivo de 1,5 x 106 células/ml infectado con AcMNPVIFN8xarg a MOI 2. La actividad biológica del producto recombinante se determinó midiendo la capacidad del rFeIFN8xarg de inhibir el efecto citopático del virus VSV sobre la línea celular felina CTFK. El nivel de expresión alcanzado fue de 12800 UI/ml de cultivo y el PI del producto recombinante fue de 9,15. Una vez separadas las células, se acondicionó el sobrenadante de expresión en buffer de siembra Tris HCl 10 mM pH 8,5 para su posterior purificación en columna de SP-Sepharose. El rFeIFN8xarg se eluyó con buffer Tris HCl 10 mM pH 8,5 con un rendimiento del 70% y un factor de purificación de 28. Se logró en un solo paso separar la albúmina bovina presente en el suero fetal bovino y las partículas virales.La modificación del PI del rFeIFN permitió su purificación por cromatografía de intercambio iónico a partir del medio de expresión. El proceso descripto es apto para su escalado.