Cinética Fractal de Beta-galactosidasa en filmes de tipo Langmuir- Blodgett

PEDRO D. CLOP; MARIA A. PERILLO

Carlos Paz - Córdoba - Argentina

Congreso; XXXIV Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Biofísica; 2005

Sociedad Argentina de Biofísica

Estudios previos sobre actividad enzimática en sistemas heterogéneos demostraron que tanto la  Beta-galactosidasa (B-Gal) soluble como el producto de la reacción que cataliza, se particionan en la interfase lípido-agua (1), Así, los equilibrios de partición y las barreras de difusión contribuyen a la modulación de la cinética de hidrólisis del sustrato. El tipo de modulación que sufrió la actividad enzimática dependió de la modalidad de interacción  B-Gal-interfase: adsorción o penetración (2). Esta última condición se investigó en mayor detalle por medio de la incorporación de  B-Gal a filmes Langmuir-Blodgett (LB), donde, sólo a altas presiones laterales (pi), se observó un comportamiento cooperativo (3), el cual estuvo ausente cuando se estudió la enzima en solución o adsorbida a membranas. Una posible explicación para este comportamiento sería el acoplamiento del orden cinético a la dimensionalidad del espacio donde transcurre la reacción, en cuyo caso se verifica que el valor de KM aparente depende de la concentración de enzima (4).   El objetivo del presente trabajo fue evaluar: a) la aplicabilidad del modelo fractal de Savageau (4) a la cinética de hidrólisis de o-nitrofenil-galactopiranósido(ONPG) catalizada por  B-Gal incorporada a filmes LB a 35 mN/m, b) el posible acoplamiento de la cinética de la reacción a la topología del filme y c) el posible relación entre la dinámica temporal de transferencia de la monocapa al soporte y la emergencia del patrón de organización molecular del filme LB. Se prepararon los filmes LB a partir de la transferencia a  pi=cte a vidrios hidrofóbicos de filmes de Langmuir de dpPC empaquetada a 35 mN/m y se permitió la incorporación de beta-Gal desde la subfase acuosa, donde su concentración varió entre 30 y 100µg/ml. Estos filmes LB se usaron como fuente de enzima; la velocidad de reacción se calculó como el cambio de A420 vs tiempo. Los datos se ajustaron a la ec.1 S: concentración de sustrato, Kf: constante fractal, vp velocidad, Vm: velocidad máxima, ge y gs: orden de reacción respecto [E] y [S]. A partir del gráfico Log(vp) vs Log([E]) se determinaron gs y Kf y, a partir de gs×Log(Kf) vs Log([E]), ge y KM eff effectiva. La fractalidad de la topología del filme observada por microscopía de fuerza atómica (AFM) y la fluctuación en los valores de  pi durante la transferencia del filme de Langmuir hacia el soporte sólido se evaluaron por medio del análisis de fluctuaciones con eliminación de tendencias (DFA) (5). El DFA permite obtener un valor (a), inversamente relacionado con la dimensión fractal (Df) de la serie de datos. Valores de  a=0.5 y 0.5>a>1 indican que la fluctuación representa ruido blanco o autocorrelación de largo alcance (fluctuación no gausiana), respectivamente.   Los valores determinados fueron gs=0.74 ± 0.03 (12) (media ± s.e.m.(n)); Log[Kf] varió entre 0.918 y 2.1042 mM para el rango de [E] ensayado; ge=2.31 y Log[KMeff]]  =28 mM. El valor de ge fue similar al reportado para la Df de la superficie de proteínas. En consecuencia, (3-ge)=0.69, sería la  Df del espacio donde transcurre la reacción y es llamativamente similar al gs calculado. La altura máxima de las imágenes (500 nm) fue 4 nm (compatible con dimensiones cristalográficas de  B-Gal) y a=0.827. La dinámica temporal de transferencia mostró un a=0.827, con pérdida de autocorrelación a un tamaño de ventana lambda=38 s, que, considerando una velocidad de transferencia de 1 mm/min, equivale a 623 µm (nivel mesoscópico). 1.Sánchez, Perillo Biophys.Chem.99: 281.2002. 2.Sánchez, Ciklic, Perillo, M.A.  Biophys.Chem.2005, (en prensa) 3.Clop E.,  Perillo, SAB2002. 4.Savageau M.A. J.Theor.Biol. 176: 115-124,1995. 5.Peng et al., Chaos 5: 82-87, 1995.