CONICET | Buscador de Institutos y Recursos Humanos

El receptor neonatal para el Fc (FcRn) es una proteína heterodimérica constituida poruna cadena transmembrana (cadena alfa) similar a la molécula de clase I del complejomayor de histocompatibilidad (MHC I), unida en forma no covalente a la microglobulinabeta2 (beta2m). La cadena alfa está constituida por tres dominios extracelulares (alfa1, alfa2 y alfa3),una región transmembrana y un dominio citoplasmático pequeño (Simister y col., 1989;Burmeister y col.,1994).Aunque el patrón de expresión del FcRn difiere entre especies, generalmente selocaliza en células de la barrera hematoencefálica, del epitelio de la vía aérea superior,de riñón, del endotelio vascular y en células presentadoras de antígenos profesionales,así como en otras células de origen hematopoyético (Roopenian y col., 2007). El FcRnse encuentra localizado principalmente en endosomas y tiene la capacidad de uniralbúmina sérica (SA) e inmunoglobulina G (IgG) mediante distintos sitios deinteracción (Raghavan y col., 1993). Tras ser endocitadas en forma pasiva, la IgG y SApueden unirse al FcRn en el endosoma tardío, a pH 6,5 o menor. El receptor y suligando son transportados hacia la membrana plasmática mediante la vía de recicladode endosomas, donde el incremento de pH, cercano a 7, provoca la liberación delligando hacia el medio extracelular, rescatándolo así de la degradación lisosomal(Roopenian y col., 2007). Mediante este mecanismo se logra prolongar la vida mediade la IgG y de la SA en circulación.En los últimos años se ha considerado la posibilidad de modular la actividad del FcRnhumano (hFcRn) con la finalidad de aumentar las propiedades farmacocinéticas deanticuerpos terapéuticos, proteínas de fusión a Fc y drogas conjugadas a SA. Ladeterminación de la constante de afinidad del hFcRn por sus ligandos permite predecirla vida media plasmática de tales moléculas, por lo que se han desarrollado estudiospre-clínicos basados en esta interacción (Seijsing y col., 2013).Desde hace unos años, nuestro laboratorio se ha orientado a la obtención deanticuerpos con potencial uso terapéutico, para su empleo en enfermedadesrelacionadas con un aumento excesivo de la producción endógena de IFN-alfa.Específicamente, se ha generado una quimera constituida por un fragmento de simplecadena scFv murino anti-IFN-alfa2b fusionado a la región Fc de la IgG1 humana.Y, porotro lado, se ha humanizado el correspondiente fragmento scFv, fusionándoloposteriormente a la mencionada región Fcgama1. De este modo, se han generadomoléculas con capacidad de neutralizar al IFN-alfa2b y con potencialidad de unir alhFcRn, sobre las cuales se proyecta realizar mutaciones sitio-dirigidas con la finalidadde aumentar su afinidad por este receptor. Debido a la importancia de establecer estaplataforma para nuestro grupo de trabajo, la expresión del hFcRn en forma soluble,obtenido mediante la tecnología del ADN recombinante (rhFcRn), constituye unavaliosa herramienta para predecir la vida media plasmática de los anticuerposterapéuticos en estudio.OBJETIVOSExpresar la región soluble del receptor neonatal humano para la porción Fcgama (rhFcRn)en su forma heterodimérica, empleando células de mamífero, a fin de contar con unaherramienta para predecir la vida media de anticuerpos terapéuticos.METODOLOGÍAClonado de la región codificante para los dominios extracelulares de la cadena alfa(alfasol) y de la beta2mA partir de plásmidos enviados a sintetizar oportunamente, se obtuvieron lassecuencias de las subunidades alfasol y beta2m. La cadena alfasol fue digerida con las enzimasXhoI/XbaI y clonada en el vector pCI-neo, que confiere resistencia a neomicina. Labeta2m fue digerida con las enzimas XhoI/SalI e incorporada al vector pLVmSA CA5E6,en fase con el marco de lectura de la secuencia señal de la SA modificada (Attallah ycol., 2017). Este vector confiere resistencia a puromicina y posee la secuenciacodificante para una etiqueta de 6 Histidinas (His6) que se empleó para la deteccióndel fragmento. En este último caso fue necesario chequear la orientación delfragmento beta2m en el vector pLVmSA CA5E6 mediante PCR, empleando unoligonucleótido que hibrida en el vector y otro complementario a la secuencia deinterés. El fragmento alfasol posee la secuencia señal propia de la subunidad alfa delhFcRn.Obtención de líneas estables CHO-K1 y HEK293 por cotransfección con lasmoléculas de interés y evaluación de la productividad mediante western blotSe transfectaron células CHO-K1 y HEK293 con las construcciones alfasol/beta2m, mediantecotransfección, empleando Lipofectamine® 2000 (Invitrogen) en la proporción 1:1 y 2:1de ADN y agente transfectante. Posteriormente, se inició una presión selectiva concantidades crecientes de antibiótico, empleándose puromicina y neomicina, con el finde seleccionar aquellas células que hayan incorporado el mayor número de copias delos genes de interés. Las líneas fueron presionadas hasta una concentración deantibiótico compatible con la viabilidad de las mismas. Debido a que la albúmina es unligando natural del FcRn y podría interferir en su detección, se evaluó la producción debeta2m y alfasol mediante SDS-PAGE (Figura 1.A, Figura 2.A) seguido de western blot(WB) (Figura 1.B, Figura 2.B) en medio libre de suero. Para dichos ensayos sedisminuyó gradualmente la concentración de suero fetal bovino en el medio de cultivohasta lograr esta condición. Por otro lado, fue necesario concentrar los sobrenadantes8,5 veces, utilizando una membrana de cut-off 10 kDa (PALL), tal como fue descritopor Feng y col. (2011). Para la detección de la beta2m se emplearon anticuerposanti-His6 y para la detección de la alfasol anticuerpos anti-hFcRnalfa, ambos producidos enconejo. Se reveló el ensayo mediante un método quimioluminiscente, empleandoanticuerpos anti-inmunoglobulinas de conejo conjugados a HRP (del inglés,horseradishperoxidase).RESULTADOSSe logró detectar la subunidad beta2m mediante WB (Figura 1.B) en el sobrenadanteconcentrado de la línea celular CHO-K1 alfasol/beta2m, generada con la proporción 1:1 deADN y agente transfectante. No se logró detectar la subunidad alfasol. Por otro lado, nose ha logrado observar la expresión de la beta2m en la línea HEK293 alfasol/beta2m. A fin deevaluar la acumulación de dicha proteína en la vía secretoria, se preparó un extractocelular mediante ciclos de congelación y descongelación, y se evaluó mediante WB.No se evidenció la beta2m en el interior de las células (Figura 1.B).CONCLUSIONESHasta el momento, no se logró obtener el hFcRn como heterodímero debido a la faltade expresión de la alfasol. Existe evidencia de que la sobreexpresión de la beta2m dificulta laasociación de ambas subunidades para obtener un FcRn funcional y, en el mismosentido, está reportada la dificultad en la estequiometria de la expresión de dosmoléculas de diferente tamaño. Actualmente, se está trabajando en mejorar laproductividad del receptor. Se emplearán sólo células humanas debido a uno de losobjetivos del grupo de trabajo, que consiste en la determinación de la constante deafinidad por el rhFcRn de los anticuerpos en estudio (lo expuesto hasta aquí sirvecomo evaluación de las construcciones generadas).BIBLIOGRAFÍA BÁSICAAttallah, C., Etcheverrigaray, M., Kratje, R., Oggero, M., 2017. A Highly Efficient ModifiedHuman Serum Albumin Signal Peptide to Secrete Proteins in Cells Derived from DifferentMammalian Species. Protein Expression and Purification, 132: 27?33.Borrok, M. J., Wu, Y., Beyaz, N., Yu, X. Q., Oganesyan, V., Dall?Acqua, W. F., & Tsui, P.,2015. PH-dependent binding engineering reveals an FcRn affinity threshold that governs IgGrecycling. Journal of Biological Chemistry, 290(7), 4282?4290.Burmeister, W.P.; Huber, A.H.; Bjorkman, P.J.,1994. Crystal structure of the complex of ratneonatal Fc receptor with Fc. Nature. 372: 379?383.Chaudhury, C.; Brooks.C.L.; Carter.D.C.; Robinson.J.M.; Anderson, C.L., 2006. Albuminbinding to FcRn: distinct from the FcRn-IgG interaction. Biochemistry. 45: 4983-4990.Feng, Y., Gong, R., & Dimitrov, D. S., 2011. Design, expression and characterization of asoluble single-chain functional human neonatal Fc receptor. Protein Expression andPurification, 79(1), 66?71.Gastinel, L. N., Simister, N. E., & Bjorkman, P. J.,1992. Expression and crystallization of asoluble and functional form of an Fc receptor related to class I histocompatibility molecules.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 89(2), 638?642.Hinton, P. R., Johlfs, M. G., Xiong, J. M., Hanestad, K., Ong, K. C., Bullock, C., Tsurushita,N., 2004. Engineered Human IgG Antibodies with Longer Serum Half-lives in Primates.Journalof Biological Chemistry, 279(8), 6213?6216.Magistrelli, G., Malinge, P., Anceriz, N., Desmurs, M., Venet, S., Calloud, S., Fischer, N.,2012. Robust recombinant FcRn production in mammalian cells enabling orientedimmobilization for IgG binding studies. Journal of Immunological Methods, 375(1?2), 20?29.Raghavan, M., Wang, Y., & Bjorkman, P. J.,1995. Effects of receptor dimerization on theinteraction between the class I major histocompatibility complex-related Fc receptor and IgG.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 92(November), 11200?11204.Roopenian, D. C., & Akilesh, S., 2007. FcRn: the neonatal Fc receptor comes of age,(August).Schoch, A., Kettenberger, H., Mundigl, O., Winter, G., Engert, J., Heinrich, J., & Emrich, T.,2015. Charge-mediated influence of the antibody variable domain on FcRn-dependentpharmacokinetics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica, 112(19), 5997?6002.Seijsing, J.; Lindborg, M.; Löfblom, J.; Uhlén, M.; Gräslund, T., 2013.Robust expression ofthe human neonatal Fc receptor in a truncated soluble form and as a full-length membraneboundprotein in fusion with eGFP.Plos One. 8 (11): 1?12.Simister, N.E.; Mostov, K.E.,1989. An Fc receptor structurally related to MHC class I antigens.Nature. 337: 184?187.Vaughn, D. E., & Bjorkman, P. J., 1998. Structural basis of pH-dependent antibody binding bythe neonatal Fc receptor.Structure (London, England : 1993), 6, 63?73.

enviar mensaje