INVESTIGADORES
ATTALLAH Carolina Veronica
congresos y reuniones científicas
Título:
IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIAS PROMOTORAS ENDÓGENAS DEL GENOMA DE CÉLULAS CHO-K1 MEDIANTE UNA METODOLOGÍA RÁPIDA
Autor/es:
ATTALLAH, C.V.; ETCHEVERRIGARAY, M.; KRATJE, R.B.; PRIETO, C.
Lugar:
Montevideo
Reunión:
Simposio; IV Seminario Latinoamericano de Tecnología de Cultivo de Células (IV SLATCC); 2010
Institución organizadora:
Institut Pasteur de Montevideo
Resumen:
La eficiente transcripción de los genes recombinantes es esencial en la producción de biofármacos a partir de cultivos de células de mamíferos. Por ésta razón, la elección de la maquinaria de expresión de la proteína de interés es uno de los factores determinantes en su producción. Los vectores de expresión frecuentemente utilizados poseen promotores virales fuertes como CMV o SV40. Estos promotores producen altas tasas de expresión, pero generan una sobreexpresión constitutiva del producto de interés, lo cual provoca un estrés permanente para la célula. Con la finalidad de evitar esta situación, nos propusimos encontrar secuencias endógenas que tengan la capacidad de regular la expresión de un gen foráneo, adaptándose a las necesidades particulares de la célula. Para este propósito se utilizó una biblioteca conformada por fragmentos del genoma de células CHO-K1. Se digirió el ADN genómico y se separaron aquellos fragmentos correspondientes a un tamaño máximo de 1000 pb. Luego, estos fragmentos se insertaron en un vector sin promotor, de tal manera que los mismos dirijan la expresión de una proteína reportera (EGFP). Los clones recombinantes fueron chequeados por PCR en colonia y aquéllos positivos se transfectaron en células CHO-K1. 24 horas post-transfección se realizó una citometría de flujo para determinar la capacidad de dichas secuencias de dirigir la expresión de EGFP. Todas las secuencias analizadas mostraron mayor actividad que el control negativo (vector sin promotor) y dos de ellas expresaron EGFP con valores similares a un promotor constitutivo (CMV). Por lo tanto, las secuencias encontradas constituyen potenciales regiones reguladoras para ser utilizadas en la expresión de genes de interés en células CHO-K1.
