Maldi tof tof como herramienta para la identificación de esfingolípidos

VANINA G. LOPEZ; LUCILA G. PESCIO; NORMA B. STERIN-SPEZIALE

Los Cocos

Congreso; Primer Congreso Argentino de Espectrometría de Masa; 2012

Los esfingolípidos (SLs) son importantes biomoléculas con relevancia estructural y funcional. Existen diversos tipos de SLs, los que a su vez difieren en su composición de ácidos grasos, conformando así una compleja familia de miles de especies moleculares. Por muchos años, su análisis se basó en técnicas cromatográficas (TLC y HPLC) las que resultan insuficientes para la caracterización de las distintas especies moleculares. Es por ello, que el desarrollo de nuevas tecnologías como la espectrometría de masa (MS) es de especial interés para el análisis de las diversas especies de SLs. Aunque ESI MS ha sido mayormente utilizada para el estudio de los lípidos, MALDI TOF TOF es un método rápido, sensible, de alta resolución, tolerante a pequeñas impurezas y que permite el análisis simultáneo de numerosas muestras. Su gran desventaja es la posible supresión de señales en mezclas biológicas debido al diferente grado de ionización de las especies moleculares de acuerdo a su composición. Por un lado, analizamos mezclas de tres especies de SLs a fin de poner en evidencia la existencia de supresión de señal. Determinamos que la esfingomielina (SM) suprime las señales de Ceramida (Cer) y Gucosilceramida (Glc Cer). Sin embargo, es posible analizar de manera conjunta la mezcla de Cer y Glc Cer sin mayores inconvenientes, al ionizarse ambas moléculas de manera semejante. Por otro lado, realizamos una optimización de la técnica de análisis por MALDI TOF TOF de los SLs provenientes de extractos celulares. Los espectros fueron obtenidos en modo positivo y la matriz utilizada fue el ácido 2,5 dihidroxibenzoico (DHB). El uso de (NH4)2SO4 impidió la formación de aductos de K+, redujo los aductos de Na+ y las señales de clusters de matriz, aumentando así la señal de las moléculas de interés. Por otro lado, se implementó el pasaje de la muestra por una micro columna C18 (Zip Tip) lo que se tradujo en un incremento de la relación señal/ruido y en la aparición de la molécula de interés intacta, lo que posibilitó la confirmación del subtipo de SL. Estas estrategias permitieron, en principio, evidenciar la comigración de Cer y Glc Cer en una única banda de TLC de fase móvil butanol: ácido acético: agua (60:20:20 v/v/v), para posteriormente identificar la presencia de nueve especies de Cer y catorce de Glc Cer.