Disrupción del gen h2az de Toxoplasma gondii mediante el sistema CRISPR/CAS9

SEBASTIAN BALERINI; LAURA VANAGAS; AGUSTINA GANUZA; SERGIO ANGEL

Santa Fe

Congreso; XXVIII Reunión Científica Anual, Sociedad Argentina de Protozoología (SAP); 2016

Toxoplasma gondii es un parásito intracelular obligado del Phylum Apicomplexa causante de la toxoplasmosis. Los moduladores epigenéticos y la alteración de la estructura de la cromatina son muy  importantes  en  la  regulación  de  la  expresión génica, la  replicación  y  el  mecanismo  de reparación  del  ADN. Las histonas canónicas  y variantes  son  componentes principales  de  la cromatina  en  células  eucariotas  y pueden  modificar  su  estructura  para  conferir  funciones especializadas.  H2A.Z  es  una  histona  variante que conforma  nucleosomas  con  H2B.Z  en T.gondii, posicionándose mayormente en promotores  de regiones  génicas  transcripcionalmente activas. Ambas histonas son modificadas post-traduccionalmente y creemos que esta regulación epigenética es fundamental para su función vital. En especies como Drosophila melanogaster y Tetrahymena  thermophila  la  H2A.Z  es esencial para  su  desarrollo  pero  no  en  levaduras, en donde ayuda  a regular funciones cromosomales y morfológicas,  y  su  ausencia  perjudica el crecimiento  en  medios  de  cultivo  específicos.  Nuestro objetivo  principal es  determinar  la importancia biológica de esta histona variante en T.gondii, para lo  cual pretendemos realizar la disrupción génica mediante el sistema CRISPR/CAS9. Para esto, se diseñaron  sgRNAs de 20-40 nucleótidos del marco  de  lectura  abierto  del  gen  H2A.Z,  que  contuvieran  el  PAM  (NGG) y  el sitio de restricción de BsaI. Se clonaron en el vector pU6 CRISPR Universal mediante el sitio de restricción  BsaI en un medio selectivo con  ampicilina. Los clones obtenidos se chequearon por PCR  y  secuenciación. Se  transfectaron  parásitos  de  la  cepa  Prugniaud  (tipo  II)  o  RH  (tipo  I)  mediante  electroporación. La proporción de parásitos con disrupción génica fue analizada por Inmunofluorescencia  Indirecta.  Se observó  que  los  parásitos  KO para  H2A.Z  manifiestan dificultades en la replicación, contabilizándose vacuolas de no más de 16 parásitos siendo en su mayoría de  2  y  4 parásitos, a las  48hs  post-infección. En  ese  mismo intervalo las  vacuolas de parásitos sin disrupción génica (WT) presentan un estadio de crecimiento entre 32 y 64 parásitos en  su  conjunto. A  las  72  y  96  h  post-infección  ya  no  se localizan parásitos  KO y  los  WT se muestran propagados por toda la monocapa celular luego de repetidos ciclos líticos. Por lo tanto, la  histona  H2A.Z cumpliría un  rol  esencial  en  la supervivencia del  parásito, y  su  ausencia dificulta la replicación