Dependencia de la actividad de la PMCA con la concentración de proteínas de membrana

LAURA VANAGAS; ROSSI ROLANDO; ARIEL J. CARIDE; ADELAIDA G. FILOTEO; EMANUEL E. STREHLER; JUAN PABLO F.C. ROSSI

Córdoba

Congreso; XXXIV Reunión anual de la Sociedad Argentina de Biofísica (SAB); 2005

La Bomba de Calcio de Membrana Plasmática (PMCA) es una enzima esencial para remover el calcio del citoplasma de todas las células eucarióticas. Hemos descrito que la actividad específica de la Ca2+-ATPasa de membranas de eritrocitos humanos, aumenta de 3 a 5 veces cuando la concentración de proteínas de membrana disminuye desde 40 hasta 1 g/ml. La dilución de la proteína no modifica la activación por ATP, Ca2+ o Ca2+-calmodulina. Esta aparente activación de la enzima no se ve afectada por la fuerza iónica y es independiente del método de medición de Pi (colorimétrico o por la determinación de la liberación de ortofosfato marcado del 32P-ATP). La activación aparente de la enzima también se observa en presencia de 0.0025-0.01% de C12E10, más allá del fenómeno de activación-inhibición propios del agregado de detergente (Congreso SAB-SAIBMB, 2003). También hemos descrito que la activación por dilución se observa en preparaciones microsomales de diferentes isoformas de la PMCA expresada en células de insecto Sf9. En este sistema, el fenómeno se puede describir como un comportamiento de activación-inhibición en función de la concentración de proteínas, que depende del grado de expresión de la PMCA y es independiente de calmodulina y calcio. (Congreso Conjunto de Sociedades Biomédicas, 2004) En el presente trabajo se utilizaron células de insecto Sf21 para sobre-expresar mediante el sistema de Baculovirus la isoforma h4b de la PMCA. Luego de 2 días post-infección, se cosecharon las células y se prepararon microsomas. Se midió el transporte de 45Ca2+ dentro de estos microsomas a 15ºC tomando muestras a diferentes tiempos y midiendo la radiactividad mediante un contador de centelleo líquido. La activación por dilución también fue observada mediante estas medidas, confirmando que es una propiedad de la PMCA. Este efecto, encontrado en membranas de eritrocitos humanos, se observa también en otros sistemas y aparece tanto en medidas de actividad de hidrólisis de ATP, como de transporte de calcio, indicando que es un fenómeno inherente a la PMCA. El fenómeno no es debido a problemas de accesibilidad y, aún en ausencia de un mecanismo hipotético firme que lo explique, resulta importante su caracterización por motivos prácticos, ya que es usual la comparación de diferentes propiedades de la PMCA como la fosforilación, la captación de calcio y la actividad enzimática a diferentes concentraciones de proteínas de membrana. Con subsidios de NIH, Fogarty International Center Grant R03TW006837, ANPCYT, CONICET y UBACYT