Identificación y evaluación de genes de enzimas antioxidantes y genes de referencia para PCR en tiempo real en sangre de Caiman latirostris

ODETTI, LUCÍA M.; PARAVANI, ENRIQUE V.; SIMONIELLO, MA. FERNANDA; POLETTA, GISELA L.

Córdoba

Jornada; XXXVII Jornadas Interdisciplinarias de Toxicología ? I Jornada Virtual Iberoamericana de Toxicología; 2020

Asociación Toxicológica Argentina

Caiman latirostris es considerado un organismo centinela para evaluar el efecto inducido por diferentes plaguicidas, ya que muchas poblaciones que viven en la región centro-norte de Argentina se encuentran en las proximidades de áreas con alta actividad agrícola. La mayoría de los biomarcadores utilizados para identificar el impacto de los plaguicidas en C. latirostris incluyen marcadores de daño al ADN, daño oxidativo al ADN y lípidos, enzimas antioxidantes y alteraciones inmunológicas. La posibilidad de aplicar marcadores de expresión génica en C. latirostris permitirá comprender el significado específico de muchas alteraciones inducidas por plaguicidas y observadas a través de los marcadores antes mencionados. A su vez, la evaluación y validación de genes de referencia en cocodrilos es limitada y la mayoría de los estudios de expresión han utilizado un solo gen de referencia sin evaluar la estabilidad de los mismos. El objetivo de este estudio fue evaluar los niveles de transcripción de los genes Catalasa (Cat) y Superóxido dismutasa (Sod) en sangre de C. latirotris, para proponerlos como biomarcadores del estrés oxidativo inducido por estresores ambientales. Además, se evaluó la estabilidad de los genes β-actina, gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) y proteína ribosomal L8 (RPL8) para ser utilizados como genes de referencia, a través de diferentes métodos: comparativo ΔCt, NormFinder, geNorm, BestKeeper y RefFinder. El porcentaje de eficiencia de la curva de amplificación en los genes de referencia, Cat y Sod osciló entre el 96% y el 110% y se clasificaron según sus perfiles de expresión como sigue: 1) β-actina (Ct promedio: 21.8), RPL8 (Ct promedio: 25.02), Sod (Ct promedio: 23.83) y Cat (Ct promedio: 22.91) en nivel medio y 2) GAPDH (Ct promedio 27.1) en nivel bajo de expresión. Se normalizaron los genes Cat y Sod con cada gen de referencia y se determinó su nivel de expresión mediante la PCR en tiempo real, observándose en ambos casos una expresión relativa similar con β-actina y RPL8. Sin embargo, todos los métodos utilizados mostraron que β-actina es el gen más estable. Este es el primer informe del análisis de genes de enzimas antioxidantes como posibles biomarcadores de estrés oxidativo en sangre para todas las especies de cocodrilos. Los niveles de expresión de Cat y Sod, junto con los demás biomarcadores de estrés oxidativo aplicados de forma rutinaria por nuestro grupo de trabajo en C. latirostris, permitirá analizar, de forma integrada, la respuesta inducida en estos animales por diferentes xenobióticos. Además, este estudio proporciona metodologías fiables para la selección y normalización de genes de referencia para obtener datos precisos en el análisis de la expresión de genes diana en cocodrilos.