Aplicación de una técnica alternativa para aislamiento de ADN genómico a partir de sangre entera en Caiman latirostris (Reptilia, Alligatoridae)

AMAVET, P.; ROSSO, E.; POLETTA, G.; LUCERO, L. Y MARKARIANI, R.

Salta, Argentina

Jornada; VIII Jornadas de Ciencias Naturales del Litoral / I Jornada de Ciencias Naturales del NOA; 2003

En  protocolos básicos para llevar a cabo el  aislamiento y purificación de ADN en distintas especies, (Maniatis et al., 1982; Moore, 1998), así como en bibliografía aplicada al grupo de los cocodrilianos (Aggarwall, 1992; Davis et al., 2000, 2001; Densmore y White, 1991; Forstner y Forstner, 2002; Glenn, et al, 1998; Lang et al., 1993; Verdade et al., 2002; Zucoloto et al., 2002), se emplean  técnicas que involucran el uso de proteinasa K en el buffer de  digestión de los componentes celulares,  una mezcla de fenol y  cloroformo-alcohol isoamílico, para la extracción del ADN y remoción de proteínas contaminantes, y posterior precipitación del material genético con alcohol etílico, y sólo en algunos casos con alcohol isopropílico. El empleo de estos compuestos han demostrado ser exitosos en cuanto a la calidad y cantidad de ADN recuperado, pero involucran el uso de productos altamente tóxicos y cáusticos, como el fenol, y otros excesivamente costosos como la proteinasa K. En el presente trabajo se expone una técnica (modificada a partir del trabajo de Murray y  Thompson de 1980), la cual supone menores costos, obteniéndose igualmente, como resultado, una apreciable concentración de ADN, utilizable para posteriores análisis mediante RAPD´s. La técnica utilizada consiste en: A  500 μl de sangre entera agregar 3 ml. de solución de lisis (Tris HCl-EDTA). Dejar reposar y luego centrifugar. Extraer el sobrenadante y  hacer 2 lavados más. Eliminar el sobrenadante del último lavado de lisis. Agregar 3 ml. de solución de digestión(CTAB :bromuro de cetiltrimetil amonio- NaCl-Mercaptoetanol-EDTA-Tris HCl). Homogeneizar y llevar a baño termostatizado a 60°  C por 3 a 4 horas. Colocar igual volumen de cloroformo. Homogeneizar. Centrifugar. Trasvasar el sobrenadante a un tubo limpio. Hacer 2 lavados más. Al último sobrenadante, colocarle 2 ml. de alcohol isopropílico. Homogeneizar. Colocar en freezer por 15 minutos. Centrifugar. Eliminar el alcohol. Secar por vaporización. Rehidratar en  1 ml. de agua bidestilada estéril. Luego del procesamiento de 47 muestras, procedentes de 25 ejemplares de Caiman latirostris (13 hembras y 12 machos), se obtuvo ADN de una concentración promedio de 1.79 μg/μl. El empleo de la mencionada técnica ha logrado buenos resultados en cuanto a la  concentración requerida de ADN para su posterior análisis por RAPD´s, aunque la pureza lograda no fue alta. Esto puede ser debido al uso de alcohol isopropílico para la precipitación. Éste es  adecuado para volúmenes grandes de solución de partida , pero al ser algunas sales menos solubles  en él, son precipitadas junto con el ADN, por lo que pueden ser necesarios varios lavados para lograr mayor pureza del ácido nucleico.