Evaluación de la frecuencia y distribución de la población de linfocitos Tγδ durante la infección crónica por Staphylococcus aureus en glándula mamaria bovina durante la involución activa

ENGLER, C; SILVESTRINI, P; BECCARIA C; SIMONUTTI V; CELLONE I; CALVINHO L.F; BARAVALLE C; DALLARD BE; RENNA M.S

Jornada; VIII Jornada de Difusión de la Investigación y Extensión Virtuales.; 2020

Al finalizar la lactancia, la involución normal de la glándula mamaria (GM) bovina es de fundamental importancia para asegurar una máxima producción de leche durante la lactancia siguiente. Durante la involución temprana comienzan a aumentar en forma significativa ciertas proteínas defensivas, así como células del sistema inmune; sin embargo, la aparición de nuevas infecciones intramamarias (IIM) se ve favorecida en esta etapa1. La mastitis bovina es uno de los mayores factores limitantes a la rentabilidad de la producción lechera en el mundo. Si bien la enfermedad es causada por numerosos agentes etiológicos, Staphylococcus aureus es el patógeno más frecuentemente aislado de casos de mastitis tanto en Argentina, como en otros países de gran desarrollo lechero. Este microorganismo causa IIM con tendencia a la cronicidad, que generan un extenso daño al tejido y son refractarias a la terapia antibiótica2. Se conoce ampliamente que la resistencia del hospedador frente a S. aureus está determinada por una coordinada interacción entre los mecanismos de defensa innatos y adaptativos. Los linfocitos Tγδ (LTγδ) constituyen una subpoblación de linfocitos T no convencionales, cuyo receptor (TCR) está formado por las cadenas γ y δ. Se ha propuesto que esta población celular innata juega un rol clave como nexo entre las dos ramas del sistema inmune3. Se conoce que esta población de LTγδ en rumiantes puede llegar a constituir más del 70% de los linfocitos circulantes de sangre periférica en animales jóvenes, lo que sugiere un rol importante en la respuesta inmune de estos animales. Particularmente, en bovinos, se han identificado varias subpoblaciones de LTγδ en base a la expresión o no de la molécula WC1 (del inglés, workshop cluster 1), una glicoproteína de transmembrana que pertenece a la súper familia de los receptores basureros (del inglés, scavenger receptors) ricos en cisteína4. Considerando que aún se desconoce el rol de la población de LTγδ bovinos durante la IIM por S. aureus, el objetivo del presente trabajo fue estudiar la frecuencia y distribución de esta población celular innata en muestras de secreción y tejido mamario provenientes de vacas crónicamente infectadas con S. aureus y vacas controles sin infección durante el período de involución activa de la GM.Para ello, se utilizaron vacas Holando Argentino, no preñadas, en el tercio final de la lactancia, pertenecientes al rodeo experimental de la EEA Rafaela (INTA). El estado de infección de cada cuarto mamario fue determinado seis meses antes del inicio del experimento y confirmado 20 y 3 días previos a la interrupción de la lactancia o secado. Se tomaron como unidades experimentales los cuartos mamarios. Se utilizaron cuartos mamarios libres de IIM (n=15) y cuartos con IIM crónicas por S. aureus (n=15). Las vacas con IIM crónicas por S. aureus fueron seleccionadas en base a resultados de recuentos de células somáticas mensuales (RCS > 250x103 células/ml) y análisis bacteriológico positivo. Un cuarto fue considerado crónicamente infectado por S. aureus luego del aislamiento de la bacteria en tres muestreos consecutivos con intervalos de 21 días. Por otra parte, se seleccionaron vacas controles con cuartos libres de IIM al tiempo de muestreo, con resultados bacteriológicos negativos y RCS menores a 150x103 células/ml. Todos los procedimientos utilizados en este estudio se realizaron de acuerdo a las normas correspondientes sobre experimentación animal (Guide for the Care and Use of Agricultural Animals in Research and Teaching. Federation of Animal Science Societies. Third edition. 2010. ISBN: 978-1-884706-11-0) y aprobados por el CAES de la FCV-UNL. Se obtuvieron muestras de secreción mamaria en forma aséptica inmediatamente antes del secado (tiempo 0) y a los 7, 14 y 21 días post secado. Las muestras fueron conservadas a 4°C e inmediatamente procesadas para realizar el enriquecimiento en células mononucleares (CMN) mediante centrifugación en gradiente de densidad (Histopaque 1077). Posteriormente, las CMN se incubaron con el anticuerpo monoclonal anti-WC1 conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) en PBS-EDTA-suero fetal bovino a 4ºC durante 30 min en oscuridad. Luego de la incubación, las CMN fueron lavadas, resuspendidas en fluido de enfoque y adquiridas utilizando el citómetro de flujo Attune NxT. Las muestras de tejido mamario se tomaron luego del sacrificio de los animales a los 7, 14 y 21 días post secado. Muestras provenientes de cuartos sanos (n=5) e infectados crónicos por S. aureus (n=5) fueron incluidas en cada grupo (7, 14 y 21 días). Los tejidos fueron procesados según técnicas histológicas de rutina e incluidos en parafina. Para la identificación y cuantificación de LTγδ WC1+ en tejido mamario se realizó imunohistoquímica utilizando el método streptavidina-biotina-peroxidasa. Brevemente, las secciones de tejido fueron desparafinadas, hidratadas y se les realizó recuperación antigénica. Seguidamente se inactivó la peroxidasa endógena y se bloquearon las uniones inespecíficas. Los tejidos fueron incubados con el anticuerpo monoclonal anti WC1 durante 18 hs a 4°C en cámara húmeda. Luego de dos lavados, las secciones se incubaron con el anticuerpo secundario biotinilado a 25oC por 30 min. La visualización del antígeno se realizó por el método estreptavidina-peroxidasa utilizándose como cromógeno 3,3-diaminobencidina (DAB). Posteriormente, se tomaron imágenes de los cortes histológicos empleando una cámara digital (Nikon DS-Fi2) montada en un microscopio (Nikon Eclipse Ci -L Ni) usando un objetivo 40X. Los LTγδ WC1+ fueron cuantificados por unidad de área (mm2) tanto en el epitelio de conductos y alvéolos (parénquima) como en el estroma de la GM. Solo se consideraron como células positivas aquellas que mostraron tinción citoplasmática intensa de color marrón (dado por el cromógeno utilizado). El análisis estadístico de los datos se realizó mediante ANOVA factorial que evalúa los efectos de la IIM, del tiempo y la interacción, utilizando el programa SPSS 11.0 para Windows. Para evaluar diferencias en cada tiempo de muestreo entre cuartos sanos e infectados se realizó t-student.Si bien no se observó un efecto de la infección a lo largo del tiempo de involución en los porcentajes de LTγδ WC1+ de secreción entre los cuartos infectados con S. aureus y controles (p=0,092), cuando se evaluó el porcentaje de estas células en ambos grupos por día de involución, se observó un aumento en el porcentaje de LTγδ WC1+ en las secreciones mamarias provenientes de cuartos infectados en comparación con secreciones de cuartos controles al día 14 de la involución (p=0,03). Al día 21 de la involución, los porcentajes de LTγδ WC1+ en las secreciones mamarias de cuartos infectados fueron menores en comparación con secreciones de cuartos controles (p