Optimización de la determinación de poblaciones leucocitarias, apoptosis y estallido respiratorio mediante citometría de flujo en sangre periférica humana para la evaluación de biofármacos

ETCHEVERS L; SILVESTRINI, P.; PERALTA MB; OLMOS NICOTRA F; BARAVALLE ME; ORTEGA HH; RENNA M.S

Jornada; VIII Jornada de Difusión de la Investigación y Extensión Virtuales.; 2020

El Centro de Medicina Comparada del ICIVET Litoral (UNL-CONICET), es el único Centro integrado a una institución del Sistema Científico-Tecnológico en el país que conjuga las certificaciones y habilitaciones correspondientes a SENASA, ANMAT, ISO 9001 y Buenas Practicas de Laboratorio (BPL)-OCDE y en el que actualmente numerosos grupos de investigación y desarrollo (I+D) realizan estudios preclínicos así como también pruebas de concepto y de control de calidad.Dentro del CMC se llevan a cabo proyectos de investigación, desarrollo y transferencia, los cuales han permitido el crecimiento constante de sus capacidades operativas y la generación de conocimientos en el área de la medicina comparada. Varios de esos proyectos han sido en colaboración con empresas del sector farmacéutico del país y el exterior. Sin bien el CMC tiene una amplia trayectoria en ensayos con animales, a lo largo de los últimos años se han diseñado y llevado a cabo diversos protocolos experimentales que han permitido el desarrollo de una gran cantidad de ensayos in vitro así como también de I+D aplicados a otras áreas. Esto se ha visto favorecido con la incorporación de equipamiento específico y recursos humanos capacitados. Dentro de los protocolos que se han ejecutado en los últimos años en el Área I+D y en el Área de Ensayos in vitro del CMC, se destacan el desarrollo de métodos alternativos para la evaluación citotóxica in vitro de materiales de uso biomédico, fármacos y biofármacos, el desarrollo de una plataforma de producción de proteínas recombinantes de interés veterinario, el desarrollo y validación de técnicas analíticas de micrométodos bajo normas BPL para el estudio de marcadores en ensayos preclínicos de alta complejidad, entre otros.Actualmente, se encuentra en vigencia un convenio entre el CMC y una empresa de ensayos clínicos destinado a un estudio de farmacocinética y farmacodinamia comparativa de formulaciones del factor estimulante de colonias de granulocitos humano recombinante (rhG-CSF). Este factor es una glucoproteína que se produce en diferentes tejidos y promueve la maduración de células precursoras localizadas en la médula ósea a neutrófilos. El G-CSF produce un aumento en la maduración de los neutrófilos y su liberación a la sangre. Por otro lado, la producción de G-CSF mediante el empleo de la técnica recombinante, ha permitido disponer de las cantidades necesarias para emplear la sustancia como fármaco en el tratamiento de enfermedades. En hematología y oncología se emplea la forma recombinante de esta glucoproteína para facilitar la recuperación de los pacientes con cáncer que sufren neutropenia como efecto secundario de la quimioterapia1. El estudio de la actividad de rhG-CSF se lleva a cabo mediante la evaluación de distintas metodologías como el recuento absoluto de neutrófilos y la determinación de estallido respiratorio en neutrófilos.Como etapa inicial del convenio previamente mencionado se desarrolló un protocolo específico, el cual es descripto en el presente trabajo. El objetivo del trabajo consistió en la optimización de la determinación del recuento absoluto de neutrófilos, apoptosis y/o necrosis celular y estallido respiratorio en muestras humanas de sangre periférica provenientes de voluntarios sanos mediante citometría de flujo. Las muestras de sangre periférica provenientes de voluntarios sanos fueron obtenidas por la empresa y remitidas al CMC bajo condiciones de bioseguridad y refrigeradas. Cabe aclarar que este protocolo fue aprobado por el comité de Ética y Seguridad de la FCV-UNL.Para todas las determinaciones planteadas, se utilizó el citómetro de flujo Attune NxT perteneciente al CMC. Las regiones delimitadas de los gráficos generados por el software del citómetro pueden ser separadas secuencialmente, de acuerdo con la intensidad de la fluorescencia, para crear una serie de subgrupos llamados "gates", siendo conocida como ?gating? su separación. Para cada metodología detallada a continuación se determinó y estableció la mejor estrategia de ?gating?.Para el recuento absoluto de neutrófilos en muestras de sangre periférica anticoagulada, previa lisis de glóbulos rojos, se utilizaron 2 marcadores específicos (anticuerpos) para identificar a la población de neutrófilos: anti-CD45 (pan leucocitario) y anti-CD16 (específico para neutrófilos)2. Se utilizaron perlas de conteo absoluto en todas las muestras para poder calcular el valor absoluto de la población de neutrófilos. Las muestras se evaluaron por duplicado y se realizó además el recuento absoluto de neutrófilos en las mismas muestras de sangre anticoaguladas mediante el uso de un contador hematológico a los fines de comparar ambas metodologías. Para ello, se utilizó un Autoanalizador hematológico Mindray BC-2800Vet y se realizaron hemogramas completos. Para la evaluación del estallido respiratorio en muestras de sangre periférica humana anticoagulada, previa lisis de glóbulos rojos, se utilizó el reactivo dihidro-rodamina (DHR) para medir la producción de especies reactivas del oxígeno y PMA (Forbol 12-miristato 13-acetato) como activador3. En presencia de las especies químicas generadas durante el estallido respiratorio de neutrófilos convenientemente activados con PMA, la DHR (no fluorescente) se oxida a rodamina (fluorescente). En este sentido, se evaluó el porcentaje de neutrófilos positivos para DHR y el cambio en la intensidad de fluorescencia media. En paralelo, se evaluaron las mismas muestras de sangre sin activar (incubadas solo con buffer fosfato salino, PBS) como controles basales de estimulación. Todas las muestras se evaluaron por duplicado. Para la evaluación de apoptosis celular en las muestras de sangre periférica humana anticoagulada se utilizó Anexina V-APC como marcador de apoptosis temprana. Cuando la célula inicia el proceso de apoptosis, ocurre la translocación de la fosfatidilserina (PS) desde la cara interna de la membrana celular a la superficie externa de la misma. Una vez en la superficie, la PS puede ser fácilmente detectada por Anexina V, una proteína que tiene alta afinidad por ella, permitiendo la detección de células en apoptosis temprana mediante citometría de flujo. Para la evaluación de apoptosis tardía y/o necrosis se utilizó la marcación con 7AAD (7-aminoactinomicina D)4. Por lo tanto, para la evaluación de apoptosis celular en las muestras de sangre periférica humana anticoagulada, previa lisis de los glóbulos rojos, las muestras se marcaron con el anticuerpo anti CD45-FITC y posteriormente con la mezcla de los colorantes Anexina V-APC y 7AAD. Las muestras se evaluaron por duplicado y se evaluaron distintas concentraciones de Anexina V y 7AAD. Todas las muestras se evaluaron por duplicado. En el presente trabajo, ha sido posible desarrollar una metodología repetible y confiable para el recuento absoluto de neutrófilos, estallido respiratorio y apoptosis. Se determinaron las concentraciones de anticuerpos y colorantes adecuados y los criterios y estrategias correctas para la obtención de resultados adecuados. Las actividades llevadas a cabo dentro del CMC se normalizan y se registran a través de los Procedimientos Operativos Estandarizados (POEs). Es por ello, que finalizado la optimización y validación de estas metodologías, es posible generar un POE que permitirá continuar, en el marco del convenio, con la evaluación de las formulaciones de rhG-CSF a partir de muestras de pacientes tratados. Por otro lado, permite al CMC contar con una metodología sólida para la evaluación de otros biosimilares o fármacos de interés.Bibliografía1. Anderlini P. 2009. Effects and safety of granulocyte colony-stimulating factor in healthy volunteers. Current Opinion in Hematology. 16:35?40.2. Van Staveren S y col. 2018. Multi-dimensional flow cytometry analysis reveals increasing changes in the systemic neutrophil compartment during seven consecutive days of endurance exercise. PLoS ONE 13: e0206175.3. Walrand y col. 2003. Flow cytometry study of polymorphonuclear neutrophil oxidative burst: a comparison of three fluorescent probes. Clinica Chimica Acta. 331: 103? 110.4. Current Protocols in Cytometry. John Wiley and Sons Inc. ISSN: 19349297.