Diseño de inhibidores específicos de la síntesis de AMPc en giardia lamblia.

DE COSTA, ANTONELLA; GARRO, ADRIANA; ENRIZ, DANIEL; DI SIERVI, NICOLAS; DAVIO, CARLOS; ZURITA, ADOLFO

Mendoza

Jornada; V jornada Bioquímicas de Cuyo; 2018

Introducción:Giardia lamblia (G. lamblia) es un parásito intestina protozoario anaeróbico, responsable de la infección intestinal llamada giardiasis (1)⁠. La giardiasis constituye una parasitosis de gran importancia epidemiológica y clínica por su alta prevalencia y patogenicidad. Esta enfermedad es la causa más frecuente de diarrea y mala absorción en el mundo, afectando a millones de personas cada año y que se origina fundamentalmente por la ingestión de agua contaminada con quistes de este parásito (2,3)⁠. El ciclo de vida de G. lamblia comprende la etapa de quiste (forma infectiva) fuera del huésped y la etapa de trofozoíto (forma replicatíva), siendo esta ultima, la forma responsable de los síntomas de la enfermedad (4)⁠. En este contexto, se han encontrado evidencias que vinculan los procesos de diferenciación adaptativa (enquistamiento/desenquistamiento) de G. lamblia con mecanismos de transducción de señales mediados por AMPciclico (AMPc) (5)⁠. En G. lamblia, el metabolismo de AMPc esta dado por tres enzimas: dos enzimas adenilil-ciclasas (gAC1 y gAC2) y una fosfodiesterasa (gPDE). Estas enzimas poseen muy baja identidad (30%) con respectos a sus homólogos en mamíferos (6)⁠, lo que las convierte en blancos para el desarrollo de agentes farmacológicos específicos.Objetivos: ? Caracterizar las propiedades bioquímicas de las enzimas responsables de la síntesis y degradación de AMPc en G. lamblia. ? Obtención (mediante modelado molecular) de datos estructurales que nos permitan diseñar y probar inhibidores específicos del metabolismo de AMPc en G. lamblia.MétodosBiología molecular: Cultivo de bacterias y G. lamblia, generación de células competentes, transformación de bacterias con vectores recombinantes, expresión heteróloga y purificación de proteínas por cromatografía de afinidad, electroforesis en geles de agarosa y acrilamida, western-blot. Bioinformática: Modelado molecular de la estructura terciaria y cuaternaria de proteínas, simulación de interacciones moleculares (docking). Resultados:Primeramente encontramos que, en cultivos in vitro, los niveles de AMPc en trofozoítos de G. lamblia, se incrementan durante el proceso de enquistamiento. Adicionalmente, observamos también que la tasa de replicación de estos trofozoítos, aumenta significativamente cuando son incubados en presencia de un análogo no hidrolizable de AMPc (dibutiril-AMPc). Estos resultados sugieren que AMPc esta involucrado en los procesos de crecimiento y diferenciación de G. lamblia. Mediante técnicas regulares de biología molecular, logramos purificar el dominio catalítico de la enzima gAC1 (6H-gAC1-301) y confirmar que la misma posee actividad adenilil-ciclasa con una KM de 15 µM de ATP y es dependiente de Mn+2 y/o Ca2+. Posteriormente, encontramos que 6H-gAC1-301 es inhibida por el compuesto 2-Hydroxyestradiol con un I50 de aproximadamente 1 µM.Con estos resultados en mente, mediante el análisis de la secuencia de gAC1, generamos un modelo de la estructura terciaria de gAC1 formando complejo con ATP-Mn2+ y/o ATP-Ca2+ en su sitio catalítico. Este modelo computacional, nos permitió calcular las interacciones del complejo gAC1-ATP-Mn2+ con el inhibidor 2-Hydroxyestradiol y comprender su mecanismo de acción. Esta ultima parte, finalmente, nos permitirá predecir el efecto de versiones modificadas del inhibidor 2-Hydroxyestradiol, sobre la actividad de gAC1 y adenilil-ciclasas homologas de mamíferos.ConclusionesDebido a la importancia epidemiología de tiene el parásito G. lamblia, resulta de extrema importancia la búsqueda de un tratamiento farmacológico especifico, que afecte el metabolismo normal del parásito con mínimas contraindicaciones para su huésped.Como punto de partida para esta meta, consideramos que nuestro modelo de estudio nos permitirá desarrollar de manera racional inhibidores enzimáticos que cumplan con este requisito.Bibliografía1. Adam RDR. Biology of Giardia lamblia. Clin Microbiol Rev [Internet]. Am Soc Microbiol; 2001 [cited 2011 Jun 30];14(3):447. Available from: http://cmr.asm.org/cgi/content/abstract/14/3/4472. Thompson RC. Giardiasis as a re-emerging infectious disease and its zoonotic potential. Int J Parasitol [Internet]. 2000 Nov [cited 2016 Aug 22];30(12?13):1259?67. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/111132533. Sons HPJW and. Waterborne disease: Epidemiology and ecology. Chichester, editor. 1997. 4. Lujan HD. Mechanisms of adaptation in the intestinal parasite Giardia lamblia. Essays Biochem [Internet]. 2011;51:177?91. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/220234495. Gibson C, Schanen B, Chakrabarti D, Chakrabarti R. Functional characterisation of the regulatory subunit of cyclic AMP-dependent protein kinase A homologue of Giardia lamblia: Differential expression of the regulatory and catalytic subunits during encystation. Int J Parasitol. 2006;36(7):791?9. 6. Vanina Saraullo, Nicolas Di Siervi, Belen Jerez CD and AZ. Synthesis and degradation of cAMP in Giardia lamblia : possible role and characterization of a nucleotidyl cyclase with a single cyclase homology domain. Biochem J. 2017;474(2017):4001?17.