Inmunolocalización de caspasa-3 activa en glándula mamaria de bovinos tratados con un modificador de la respuesta biológica durante la involución

HEFFEL SS,; RUFFINO V,; BARAVALLE C,; DALLARD BE.

Santa Fe. Argentina.

Otro; XI Encuentro de jóvenes investigadores de la Universidad Nacional del Litoral. II Encuentro de Jóvenes Investigadores de Universidades de Santa Fe.; 2007

Universidades de la Provincia de Santa Fe

Introducción: El periodo de secado es una parte crítica del ciclo de la lactancia en vacas lecheras  y es esencial para asegurar una óptima producción de leche en la lactancia siguiente. Durante el período no lactante se originan infecciones intramamarias (IIM) que pueden reducir la producción láctea hasta en un 30% comparando con cuartos mamarios no infectados. Staphylococcus aureus es un patógeno mayor  de la ubre y produce serios problemas de pérdidas económicas para la industria lechera. Las IIM por esta bacteria tienden a hacerse crónicas y a menudo resisten las terapias antibióticas.  Tradicionalmente, el control de las IIM durante el período de vaca seca se realiza con antibióticos de acción prolongada. Las limitantes de esta práctica determinan la necesidad de explorar potenciales medidas de control que impliquen la manipulación del sistema inmune de la glándula mamaria bovina. Los modificadores de la respuesta biológica (MRB) o compuestos inmunomoduladores se han utilizado individualmente para potenciar regímenes de terapia antibiótica o de inmunización específica (vacunas), y pueden convertirse en una alternativa eficaz a los métodos tradicionales de control de las enfermedades. La remodelación de la glándula mamaria depende de un equilibrio dinámico entre dos procesos opuestos: mitosis y apoptosis. La apoptosis es responsable de la pérdida de células durante la involución mamaria luego del destete natural o la remoción de las crías en roedores y durante el secado en rumiantes. La apoptosis es una forma de muerte celular ATP dependiente, caracterizada morfológicamente por condensación de la cromatina, fragmentación nuclear y disminución del tamaño de la célula. El resultado final de la apoptosis es la fragmentación de la célula en cuerpos apoptóticos limitados por membrana que son rápidamente removidos por células fagocíticas. Bioquímicamente la apoptosis se caracteriza por activación de las caspasas, proteasas altamente específicas que activan sustratos intracelulares. Se han descripto dos clases de proteasas especializadas, las caspasas iniciadoras (caspasas 2, 8, 9 y 10)  y las caspasas efectoras (caspasas 3, 6 y 7). Las caspasas iniciadoras se activan después de un estímulo apoptótico por autoproteolisis. Las caspasas efectoras o ejecutoras se activan por las caspasas iniciadoras en una cascada amplificadora. La activación de la ola de caspasas inicia una cascada proteolítica que lleva a la fragmentación del DNA y al clivaje de proteínas reguladoras claves que llevan a la muerte celular. Dentro de este contexto, el objetivo del presente trabajo fue cuantificar la marcación de caspasa-3 activa (caspasa efectora) como indicador de apopotosis en glándula mamaria de bovinos infectados y no infectados con S. aureus tratados con un MRB durante la involución. Materiales y Métodos: Se utilizaron vacas Holstein no preñadas al final de la lactancia. La infección de los cuartos mamarios con S. aureus fue considerada como covariable. El estado de infección de los cuartos mamarios fue determinado seis meses antes de la iniciación del experimento y confirmado 20 y 3 días previos a la inoculación. El MRB y placebo (solo vehículo) fueron inoculados en cuartos mamarios de tres grupos de 12 vacas que fueron sacrificadas a los 7, 14 y 21 días post infusión. Cuartos mamarios no infectados (n=6) e infectados con S. aureus (n=6) fueron incluidos en cada grupo (7, 14 y 21 días). En todos los casos la lactancia fue interrumpida luego de la infusión intramamaria. El MRB utilizado contiene 0.35 moles de lipopolisacárido (LPS) de una cepa no patógena de Escherichia coli, 45 mg/100 ml de fracciones membranosas y ribosomales de la misma cepa, liposomas y gentes de formulación. Las muestras de cada cuarto fueron tomadas en la porción dorso-lateral del parénquima mamario a 4 cm de profundidad y se fijaron en formol bufferado al 10% según protocolos histológicos de rutina. La expresión de  caspasa-3 activa se evaluó por inmunohistoquímica (IHQ) (método streptavidina-peroxidasa) y se cuantificó mediante análisis de imágenes con el programa Image Pro-Plus 3.0.1® (Media Cybernetics, Silver Spring, MA, USA). Luego de la realización de la IHQ para caspasa-3 activa,  se contabilizaron las células epiteliales y estromales que mostraron marcación positiva en el área perinuclear y en el citoplasma y se obtuvieron los porcentajes. Las células fueron clasificadas como epiteliales con marcación (+), estromales con marcación (+), epiteliales con marcación (-) y estromales con marcación (-). Las células fueron contadas como epiteliales si formaban parte del tejido secretor lo que incluyó a las células epiteliales y mioepiteliales y posibles leucocitos que pudieran estar presentes en el lumen alveolar. Todas las células propias del tejido conectivo fueron clasificadas como células estromales incluyendo fibroblastos, adipocitos y células endoteliales; también se contabilizaron los leucocitos. El análisis estadístico se realizó por ANOVA y test de Duncan utilizando el software SPSS (versión 11.0 para Windows, SPSS Inc.®). Resultados: Los resultados del efecto del tratamiento con MRB sobre los porcentajes de células epiteliales y estromales inmmunomarcadas con caspasa-3 activa en cuartos mamarios no infectados e infectados con S. aureus durante la involución se detallan en las tablas 1 y 2. Los resultados del efecto del tratamiento con MRB sobre los porcentajes de células epiteliales y estromales inmmunomarcadas con caspasa-3 activa en cuartos mamarios no infectados e infectados con S. aureus durante la involución se detallan en las tablas 1 y 2. Los resultados del efecto del tratamiento con MRB sobre los porcentajes de células epiteliales y estromales inmmunomarcadas con caspasa-3 activa en cuartos mamarios no infectados e infectados con S. aureus durante la involución se detallan en las tablas 1 y 2. Los resultados del efecto del tratamiento con MRB sobre los porcentajes de células epiteliales y estromales inmmunomarcadas con caspasa-3 activa en cuartos mamarios no infectados e infectados con S. aureus durante la involución se detallan en las tablas 1 y 2. Los resultados del efecto del tratamiento con MRB sobre los porcentajes de células epiteliales y estromales inmmunomarcadas con caspasa-3 activa en cuartos mamarios no infectados e infectados con S. aureus durante la involución se detallan en las tablas 1 y 2. Los resultados del efecto del tratamiento con MRB sobre los porcentajes de células epiteliales y estromales inmmunomarcadas con caspasa-3 activa en cuartos mamarios no infectados e infectados con S. aureus durante la involución se detallan en las tablas 1 y 2. Los resultados del efecto del tratamiento con MRB sobre los porcentajes de células epiteliales y estromales inmmunomarcadas con caspasa-3 activa en cuartos mamarios no infectados e infectados con S. aureus durante la involución se detallan en las tablas 1 y 2. Los resultados del efecto del tratamiento con MRB sobre los porcentajes de células epiteliales y estromales inmmunomarcadas con caspasa-3 activa en cuartos mamarios no infectados e infectados con S. aureus durante la involución se detallan en las tablas 1 y 2. Los resultados del efecto del tratamiento con MRB sobre los porcentajes de células epiteliales y estromales inmmunomarcadas con caspasa-3 activa en cuartos mamarios no infectados e infectados con S. aureus durante la involución se detallan en las tablas 1 y 2. En cuartos infectados, el tratamiento con MRB, produjo un incremento significativo (P<0.05) en el número de células epiteliales y estromales inmunomarcadas con caspasa-3 activa durante todos los periodos evaluados. En cuartos no infectados, el tratamiento con MRB, produjo un incremento significativo (P<0.05)  en el número de células epiteliales marcadas con caspasa-3 activa al día 7 del secado; mientras que en células estromales el aumento fue significativo en todos los estadios estudiados. Tabla 1: Efecto del tratamiento con un modificador de la respuesta biológica (MRB) sobre el porcentaje de células epiteliales inmunomarcadas con caspasa-3 activa en cuartos mamarios no infectados e infectados con S. aureus durante la involución.                            Cuartos infectados con S. aureus                 Cuartos no infectados Días de involución MRB PLACEBO MRB PLACEBO 7 días 3.894 (0.175)a 1.682 (0.105)e,f 2.643 (0.047)b,c 2.039 (0.125)d,e 14 días 2.867 (0.059)b 2.398 (0.088)cd 2.409 (0.163)c,d 2.567 (0.140)b,c 21 días 2.911 (0.125)b 2.306 (0.094)c,d 2.278 (0.088)c,d 2.524 (0.230)b,c Los valores representan medias de los porcentajes de células inmunomarcadas ± SEM; a,b,c,d,e,f  Diferentes letras para cada tratamiento y días de involución indican diferencias significativas  (P<0.05). Tabla 2: Efecto del tratamiento con un modificador de la respuesta biológica (MRB) sobre el porcentaje de células estromales inmunomarcadas con caspasa-3 activa en cuartos mamarios no infectados e infectados con S. aureus durante la involución.                            Cuartos infectados con S. aureus                 Cuartos no infectados Días de involución MRB PLACEBO MRB PLACEBO 7 días 6.438 (0.486)a 4.102 (0.107)d 5.221 (0.183)b,c 2.778 (0.104)e 14 días 5.547 (0.266)b 4.292 (0.248)d 5.648 (0.103)b 3.288 (0.179)e 21 días 5.539 (0.232)b 5.442 (0.186)b 5.503 (0.211)b 4.338 (0.170)d Los valores representan medias de los porcentajes de células inmunomarcadas ± SEM; a,b,c,d,e Diferentes letras para cada tratamiento y días de involución indican diferencias significativas  (P<0.05). Conclusiones: La inoculación de un MRB a base de LPS bacteriano al momento del secado en cuartos mamarios infectados con S. aureus y no infectados aumentó los   porcentajes de inmunomarcación con caspasa-3 activa (caspasa efectora) de las células estromales y epiteliales de la glándula mamaria bovina durante la involución. Estos datos sugieren que el tratamiento con MRB en cuartos crónicamente infectados y en cuartos sanos estimula la apoptosis de los componentes del estroma y parénquima mamario contribuyendo de esta manera a acelerar el proceso de involución de la glándula mamaria bovina.