Puesta a punto de extracción de ARN total y expresión de Interleuquina-1 (alfa y beta) mediante RT-PCR en muestras de leche bovina

BARAVALLE C,; ALFARO N,; ANDREOTTI C,; DALLARD BE,; CALVINHO LF,; ORTEGA H

Córdoba, Córdoba Argentina

Congreso; XI Congreso Argentino de Ciencias Morfológicas. I Congreso Internacional de Educación e Investigación en Ciencias Morfológicas. I Encuentro de Histotecnólogos; 2008

Sociedad Arg de Cs. Morfológicas, II Cát. de Biología Celular, Histología y el Ctro. de Microscopiá Electrónica de la Fac. de Cs. Médicas de la UNC.

Las interleuquinas (IL) forman un subgrupo dentro de las citoquinas, y entre otras se encuentran: la IL-1alfa y la IL-1beta, las cuáles son producidas principalmente por monocitos-macrófagos. El objetivo del presente trabajo consistió en poner a punto la extracción de ARN total de células somáticas en leche bovina seguida de trascripción reversa acoplada a la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) para determinar la expresión de estas citoquinas mediante primers específicos. Al pellet de células somáticas obtenido luego de sucesivas centrifugaciones se lo trató con TRIZOL® LS Reagent, luego se le adicionó cloroformo y se lo centrifugó para separar la fase acuosa (ARN total) de la fase orgánica (ADN, restos celulares y proteínas). La precipitación del ARN extraído se realizó con alcohol isopropílico. El ARN obtenido se almacenó a -80 ºC. Para la preparación del ADNc se tomó una alícuota de ARN total extraído y se lo incubó a 65 ºC durante 5 minutos con la siguiente mezcla (Random primers, dNTPS, agua libre de ARNsas) para lograr la desnaturalización del ARN. Luego se agregó el buffer de la enzima M-MLV (Transcriptasa Reversa), DTT y RNAsa Out en cantidades adecuadas. Por último se agregó la enzima M-MLV y se incubó de acuerdo al siguiente protocolo: 25ºC 10min + 37ºC 50min + 70ºC 15min. Al producto de la reacción se le realizó PCR utilizando primers diseñados según datos publicados en la bibliografía y analizados mediante programas de  bioinformática para IL-1 alfa y  IL-1beta. El número de ciclos realizados y la temperatura de anneling se pusieron a punto previamente para cada par de primers.  Se realizaron controles negativos que consistieron en la amplificación del ARN total sin realizar retrotranscripción con ambos primers. Los productos amplificados se analizaron en un gel de agarosa al 2% teñido con GelRedTM (Biotium). Mediante el análisis no-cuantitativo se determinó la presencia de dos bandas fuertemente marcadas. Una en aproximadamente 300 pb (para la calle sembrada con la muestra amplificada con primers para la IL-1alfa) y otra banda en 230 pb (para la amplificada con primers para la IL-1 beta). No se observaron bandas en los controles negativos. En base a estos resultados podemos concluir que el método de extracción de ARN utilizado, la selección de los primers y las condiciones empleadas para la amplificación de las IL-1 (alfa   y beta) fueron adecuadas para leche bovina y pueden ser de utilidad para futuros trabajos en leches con células somáticas aumentadas.