CUANTIFICACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA DEL FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN NUCLEAR NFkB EN GLÁNDULA MAMARIA BOVINA INOCULADA CON Panax ginseng

SILVESTRINI P; DALLARD BE; BARAVALLE C

Santa Fe

Encuentro; XVIII Encuentro de Jóvenes Investigadores de la UNL.; 2014

Universidad Nacional del Litoral

INTRODUCCIÓNLa involución de la glándula mamaria bovina (GMB) es un proceso necesario para garantizar la máxima producción de leche en la próxima lactancia. Durante este periodo la GMB es altamente susceptible a contraer infecciones intramamarias (IIM). La mastitis bovina es una enfermedad con alta prevalencia en los rodeos lecheros,  causada por numerosos agentes etiológicos. Tradicionalmente, el control de IIM durante el periodo no lactante se realiza con antibióticos de acción prolongada. El uso excesivo de antibióticos promueve la aparición de cepas bacterianas resistentes, con implicancias para la salud animal y humana por el riesgo del pasaje de las cepas resistentes a la cadena alimentaria (Sandholm y Pyoörälä, 1995). Los avances tecnológicos en inmunología han proporcionado nuevas herramientas para el estudio de la inmunidad de la GMB y la patogénesis de la mastitis. La capacidad inmunológica de las células inflamatorias puede ser activada por compuestos modificadores de la respuesta inmune (MRI) (Zecconi y col., 1999; De y Mukherjee, 2013). Al modificar la respuesta inmune, los MRI, podrían utilizarse en el inicio de la involución, disminuyendo la aparición de nuevas IIM y el uso de antimicrobianos (Zecconi y col., 1999). Uno de los MRI evaluados es el extracto de la raíz de Panax ginseng (PG). Este contiene múltiples componentes incluyendo ginsenósidos, los que constituyen su principal componente activo. Resultados obtenidos por Baravalle y col. (2010; 2011) y Dallard y col. (2011;2013) han mostrado que la aplicación intramamaria de un extracto de PG al momento del secado estimuló de manera significativa la expresión de citoquinas proinflamatorias, tanto en leche como en tejido mamario durante la primera semana de la involución y contribuyó a acelerar el proceso de remodelación durante este periodo. Si bien estos estudios han demostrado la capacidad inmunomoduladora de PG, el mecanismo de acción no se ha dilucidado aún. Los criterios comunes que se han utilizado para evaluar las propiedades inmunoregulatorias de PG abarcan estudios sobre secreción de citoquinas, expresión de marcadores de superficie, fagocitosis y citotoxicidad; existiendo escasa información sobre los componentes implicados en la vía de señalización (Kang y Min, 2012). Los receptores tipo toll (TLRs) son receptores específicos presentes en la superficie o en el interior de las células tanto inmunes como las presentes en la GMB. La cascada de señalización de TLR2 y TLR4 implica la activación del factor de transcripción nuclear-kappa B (NFkB). El NFkB es un complejo proteico y su activación involucra la fosforilación y degradación de una proteína inhibitoria (IkB) que lo mantiene secuestrado en el citoplasma. Así, se transloca al núcleo, donde ejerce su acción transcripcional, uniéndose a la región promotora de los genes que codifican para las citoquinas inflamatorias, como TNF-a, IL-1b e IL-6, que en acción coordinada producen respuestas inflamatorias locales y sistémicas (Kawai y Akira 2007).En cuanto a esto, resultados preliminares obtenidos por Baravalle y col. (2011) demostraron que PG posiblemente utilizaría la vía de TLR 2 y 4 para inducir la síntesis de citoquinas. Por otro lado, Silvestrini y col. (2013), observaron un aumento significativo en el porcentaje de núcleos de células mamarias inmunomaracadas con el anticuerpo anti-NF-kBp65 por inmunohistoquímica (IHQ), en cuartos tratados con PG en relación a los controles, hipotetizando que el extracto utilizado activaría la translocación nuclear de  NF-kB y consiguiente activación de genes para citoquinas. OBJETIVOSTeniendo en cuenta estos antecedentes y con el objetivo de verificar si NFkB interviene en el mecanismo de acción de PG, en el presente trabajo se propone  evaluar la expresión génica del NFkB en GMB inoculada con PG y controles por qPCR en tiempo real y compararlos con los hallados previamente por IHQ. MATERIALES Y MÉTODOSLa unidad experimental fue el cuarto mamario. Se utilizaron 6 vacas Holstein con glándulas clínicamente sanas. Luego del último ordeño, 8 cuartos fueron inoculados por vía IM con un extracto de PG (3 mg/ml, 10 ml), 6 fueron inoculados con placebo (solución fisiológica, 10 ml) y 6 fueron mantenidos sin inoculación (controles). A los 7 días post tratamiento, se obtuvieron muestras de tejido mamario de manera aséptica, a partir de las cuales se extrajo ARN total utilizando la metodología del reactivo Trizol. A partir de ellos se realizaron tratamientos con ADNasa I para eliminar posibles contaminaciones con ADN genómico. Posteriormente, se realizaron transcripciones reversa para la obtención de ADNc. A partir de cada uno de los ADNc obtenidos se llevaron a cabo qPCR en tiempo real, utilizando cebadores específicos para NFkB. Como gen normalizador de la reacción se utilizó la Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), cuya expresión es constitutiva y estable en todos los estadios celulares y condiciones. Para las reacciones de PCR en tiempo real se optimizaron protocolos de PCR utilizando la tecnología SYBR Green I en un StepOne Real Time PCR System (Applied Biosystems). Para ambos genes, todas las mediciones fueron realizadas por duplicado y las eficiencias de las reacciones se evaluaron por medio de una curva estándar de 7 puntos y calculadas usando el software StepOne v2.3 (Applied Biosystems). Estas curvas estándares se construyeron a partir de diluciones seriadas de un pool de ADNc. En todas las reacciones se incluyeron controles negativos. Además, para confirmar la pureza de los productos se realizaron curvas de disociación. Los niveles de expresión de NFkB  se analizaron según el valor de su Ct (del inglés: cycle threshold). Dicho valor corresponde al ciclo en el que la señal de fluorescencia puede ser detectada como valor de corte. La cuantificación de los niveles de expresión del NFκB se realizó a través del método del 2-ΔΔCt (Livak and Schmittgen, 2001). A partir de los datos arrojados por la técnica de qPCR, se llevó a cabo el análisis estadístico, donde las diferencias entre los tratamientos fueron analizadas mediante el test no paramétrico Kruskal-Wallis utilizando el software SPSS 15.0 para Windows.RESULTADOSComo resultado de la optimización de la técnica de PCR en tiempo real para el gen NFkB se obtuvo una eficiencia calculada del 102,84 % (R2: 0,998) y en donde la curva de melting mostró un único producto, determinando así la especificidad de la reacción con el cebador utilizado (Figura 1). Figura 1: Gráfico de Curva estándar para el gen NFkB (izquierda). Curva de disociación para los productos amplificados por PCR en tiempo real (derecha).Si bien el nivel de expresión relativa de ARNm para NFkB en tejido mamario  proveniente de cuartos tratados con PG fue levemente mayor que el observado en cuartos tratados con placebo y controles sin tratamiento, no se observaron diferencias significativas entre los tres grupos evaluados  (P>0,05) (Figura 2). Figura 2: Expresión relativa de NFkB en cuartos mamarios tratados con PG y controles. Las barras representan los valores medios ± SEM.CONCLUSIÓNDe los resultados obtenidos se puede concluir que si bien la expresión de NFkB en los cuartos tratados con PG fue mayor a la observada en los controles, la misma no fue significativa. Si nos basamos en trabajos previos obtenidos por el grupo donde se observó una alta expresión en el núcleo de la proteína NF-kBp65 por IHQ, indicando su traslocación nuclear, la falta de diferencia en la expresión génica podría explicarse por la alta dispersión de los resultados obtenidos, revelada por la amplitud de las barras de error. Un aumento en el número de muestras por grupo contribuiría a disminuir la dispersión de los resultados y a determinar si existen diferencias estadísticamente significativas entre los grupos evaluados. BIBLIOGRAFÍABaravalle C, Dallard BE, Ortega HH, Neder VE, Canavesio VR, Calvinho LF. (2010). Effect of P. ginseng on cytokine expression in bovine mammary glands at drying off. Vet. Immunol. Immunopathol. 138:224-230.Baravalle C, Dallard BE, Cadoche MC, Pereyra EA, Neder VE, Ortega HH, Calvinho LF. (2011). Proinflammatory cytokines and CD14 expression in mammary tissue of cows following intramammary inoculation of Panax ginseng at drying off. Vet. Immunol. Immunopathol. 144:52-60.Dallard BE, Baravalle C, Andreotti C, Ortega HH, Neder V, Calvinho LF. (2011). Intramammary inoculation of Panax ginseng extract in cows at drying off enhances early mammary involution. J. Dairy Res. 78:63-71.Dallard BE, Pujato S, Baravalle C, Pereyra EA, Rey F, Renna MS, Calvinho LF. (2013). Intramammary infusion of Panax ginseng extract in the bovine MG at cessation of milking modifies components of the IGFs during involution. Res. Vet. Sci. 49:462-470De UK, Mukherjee R. (2013). Dynamics of milk leukocytes in response to a biological response modifier during bovine subclinical mastitis. Res Vet Sci. 95:352-357.Eberhart RJ. (1986). Management of dry cow to reduce mastitis. J. Dairy Sci. 69:1721-1729.Kang S, Min H. (2012). Ginseng, the ´Immunity Boost´: The Effects of Panax ginseng on Immune System. J. Ginseng Res. 36:354-368.Kawai T, Akira S. (2007). Signaling to NF-kappaB by Toll-like receptors. Trends Mol Med 13:460-469.Livak, K.J., Schmittgen, T.D. (2001). Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods 25:402-408.Sandholm M, Pyorala S. (1995). Dry cow therapy. In: The bovine udder and mastitis. Sandholm M, Honkanen-Buzalski T, Kaartinen L, Pyorala S (eds.). University of Helsinky, Faculty of Veterinary Medicine. Pp 209-214.Silvestrini P, Duré AB, Andreotti CS, Renna MS, Ortega HH, Calvinho LF, Dallard BE, Baravalle C. (2013). Análisis de la activación y consecuente translocación del factor de transcripción nuclear (NF-κB) en glándula mamaria bovina inoculada con un compuesto inmunoestimulante. XIV Jornadas de divulgación Técnico-Científicas 2013 de la Facultad de Ciencias Veterinarias, UNR. Jornada Latinoamericana y I Congreso de Desarrollo Ganadero Sustentable. Casilda - Santa Fe.Zecconi A, Bronzo V, Casula A, Luzzago C, Moroni P, Piccinini R, Spreafico G. (1999). Efficacy of a biological response modifier in preventing Staphylococcus aureus intramammary infections after calving. J. Dairy Sci. 82:2101-2107.