Evaluación de la capacidad de persistencia en células epiteliales mamarias bovinas de 5 cepas de Staphylococcus aureus aisladas de infecciones intramamarias transitorias y persistentes.

PIROLA S; SORIA ALFONSO, MA FER; VELÁZQUEZ, NATALIA S.; BARAVALLE C; CALVINHO LF; RENNA MS; DALLARD B

Esperanza

Jornada; X JORNADAS DE DIFUSIÓN DE LA INVESTIGACIÓN Y EXTENSIÓN − FCV-UNL- 2022; 2022

FCV-UNL

La mastitis es la inflamación de la glándula mamaria (GM) en respuesta a una agresión local al tejido. Si bien el origen puede ser mecánico, tóxico o infeccioso, la mayoría de los casos de mastitis bovina se deben a infecciones bacterianas. Esta patología es la más frecuente de las vacas lecheras y tiene efectos negativos sobre el bienestar animal, la rentabilidad del establecimiento lechero y el uso indiscriminado de antibióticos que afectan la salud pública1. Dentro de los agentes causantes de mastitis bovina, Staphylococcus aureus es el patógeno contagioso más frecuentemente aislado, tanto en Argentina, como en otros países de gran desarrollo lechero. A pesar de ser considerada una bacteria extracelular, se ha demostrado que puede comportarse como intracelular dado que posee la habilidad de invadir y sobrevivir dentro de células epiteliales mamarias (CEM), neutrófilos y macrófagos2. Esta forma de vida intracelular podría facilitar la persistencia de S. aureus en la GM al limitar el éxito de la terapia antibiótica y protegerlo de las defensas inmunes del hospedador. De esta manera, S. aureus tiende a permanecer en la GM originando infecciones crónicas que ocasionan daños permanentes al tejido mamario sin producir inflamación aparente y/o manifestación clínica2. Trabajos previos han demostrado que la capacidad de adherencia, invasión y persistencia en la GM bovina guardan relación directa con determinadas características fenotípicas y genotípicas de las cepas de S. aureus3, entre ellas, la capacidad de formar biopelículas, la formación de cápsula, el grupo agr y la expresión de genes que codifican para proteínas superficiales como las proteínas de unión a fibronectina3. El objetivo del presente trabajo fue evaluar la capacidad de diferentes cepas de S. aureus de persistir en células epiteliales mamarias bovinas. Las cepas empleadas fueron previamente aisladas de infecciones intramamarias (IIM) transitorias (T) y persistentes (P) y seleccionadas en función de sus características fenotípicas y genéticas. Este trabajo es la continuación de los resultados presentados en las jornadas del EJI 2021.Se seleccionaron 5 cepas de S. aureus con diferentes perfiles genéticos y capacidad de adaptación a la GM bovina. Previamente, se evaluaron las relaciones clonales entre los aislados mediante electroforesis en campos pulsados (PFGE)4 y las cepas fueron caracterizadas mediante genotipificación de ADN basado en microarreglos para garantizar la diversidad genética, lo que permitió asignar cada cepa a un complejo clonal4. Las cepas se consideraron de alta o baja adaptación según su re-aislamiento post-tratamiento antibiótico. Las cepas aisladas por única vez del cuarto mamario y que no fueron re-aisladas durante la lactancia en muestreos consecutivos mensuales se consideraron de baja adaptación a la GM o T (cepas: 48, 179 y 806). Mientras que las cepas re-aisladas del mismo cuarto mamario durante tres o más muestreos consecutivos mensuales durante la lactancia en un periodo de 6 meses fueron consideradas altamente adaptadas a la GM bovina o P (cepas: 316 y 5128).Se evaluó la capacidad de las cepas de S. aureus de sobrevivir intracelularmente en una línea de células epiteliales mamarias bovinas (Transformed mammary epithelial cells, MAC-T) durante 4, 10, 24, 48, 72 y 96 h post infección. La multiplicidad de infección (MOI) empleada para infectar la monocapa de células MAC-T fue de 30 bacterias/células. Para favorecer la adherencia e internalización de las bacterias, las placas con el co-cultivo se incubaron durante 2 h a 37°C en atmósfera de 5% de CO2. Luego se lavaron con una solución de PBS estéril 1X y se incubaron por 2 h con medio de cultivo conteniendo gentamicina (300 µg/ml) a fin de eliminar las bacterias extracelulares que no hubiesen logrado la internalización. Post-incubación, se lavaron las monocapas celulares con PBS 1X y se agregó Tritón en agua destilada estéril a los pocillos correspondientes a las 4 h post-infección. A partir de los lisados celulares se realizaron diluciones seriadas en base 10, las cuales se sembraron por triplicado en placas de agar manitol salado que fueron incubadas por 24 h a 37°C. Finalmente, se contabilizó el número de unidades formadoras de colonias (UFC) intracelulares recuperadas. Al resto de los pocillos se les realizó el cambio de medio de cultivo suplementado con gentamicina cada 24 h. Este procedimiento se realizó a fin de evitar el agotamiento de nutrientes y la reinfección de la monocapa por las bacterias que fueran liberadas por las células que mueren. Finalizado cada uno de los tiempos de infección evaluados se procedió de la misma manera que se mencionó anteriormente con los pocillos correspondientes a las 4 h. Estos ensayos se realizaron por triplicado para cada una de las cepas evaluadas. El análisis estadístico de los datos se efectuó mediante un modelo lineal generalizado con función de enlace gamma utilizando el programa SPSS 11.0 para Windows. La distribución de las variables fue analizada mediante el test Kolmogorov-Smirnov.En todas las cepas estudiadas se observó una disminución gradual del número de UFC recuperadas durante los diferentes tiempos de infección. No se observó relación entre la capacidad de este patógeno de persistir en células MAC-T y el origen del mismo (cepas T o P) para cada uno de los tiempos evaluados. La cepa con menor capacidad de persistencia fue la 806 (T), la cual se logró recuperar hasta las 24 h post-infección, mientras que la cepa 179 (T) se logró recuperar hasta las 96 h. La cepa 316 (P) se recuperó hasta las 72 h y el resto [48 (T) y 5128 (P)] persistieron hasta las 48 h. A las 10 h post-infección la cepa 179 (T) difirió significativamente del resto (p