Establecimiento in vitro de Zephyranthes filifolia

FERNÁNDEZ A. C., CURVETTO N. R. Y MARINANGELI P. A.

Corrientes, Argentina

Congreso; IV Congreso Argentino de Floricultura y Plantas Ornamentales, y 10a jornadas nacionales de floricultura; 2008

Zephyranthes filifolia es una especie geófita nativa de la región semiárida argentina de potencial valor ornamental y útil para el fitomejoramiento del género. La especie  no se propaga naturalmente de forma vegetativa o lo hace muy lentamente y la obtención de plantas floríferas a partir de semillas también es lenta e ineficiente debido a que las plantas demoran cerca de 3 años en producir un bulbo maduro. El establecimiento de protocolos de cultivo de tejidos para la propagación clonal permite sortear esta dificultad, resultando a su vez en un medio adecuado para la aplicación de otras biotécnicas para el estudio y mejoramiento de esta especie. Una posibilidad como vía de obtención de plántulas in vitro es la germinación de semillas en medio estéril. Furmanowa y Oledzka (1983) proponen la obtención de explantos desde semillas desinfectadas germinadas en cajas de Petri sobre papel húmedo estéril, aunque la germinación directa en el medio de cultivo sería una forma más sencilla de establecimiento in vitro (Rosselló et al., 2004; Piro, 2007). Sin embargo, las semillas de muchas especies no son capaces de germinar en medio de cultivo semisólido, germinan menos o lo hacen muy lentamente. La alternativa sería iniciar el cultivo in vitro a partir de los embriones cigóticos extraídos desde las semillas (van del Valk et al., 1992). Partiendo de semillas se recomienda desinfección en dos pasos, con un período de imbibición entre medio, ya que en este estando se facilita la extracción del embrión. Para la germinación en condiciones de esterilidad, una sola desinfección puede ser suficiente, si bien en Habranthus gracilifolius la doble desinfección resultó en una mejor energía germinativa (Piro, 2007). Otra ventaja del establecimiento a partir de semillas es su mayor tolerancia a los agentes de desinfección, pero como pueden alojar microorganismos en la estructura rugosa de su cobertura, su erradicación puede ser más difícil. El objetivo de este ensayo fue evaluar la eficiencia de dos métodos de desinfección de semillas y el efecto de dos medios de cultivo sobre el establecimiento in vitro de Zephyranthes filifolia. Materiales y métodos Se utilizaron semillas de Zephyranthes filifolia con 90% de poder germinativo, recolectadas de una población silvestre Bahía Blanca (Lat.: 38º 42´ S, Long.: 62º 16´ W). Se evaluaron dos técnicas de desinfección: simple y doble (Rosselló et. al, 2004). En la desinfección simple (DS) las semillas fueron lavadas 15 minutos bajo chorro de agua corriente y luego se sumergieron durante 1 minuto en etanol 70% y luego 15 minutos en una solución acuosa de ClONa (0,8% de cloro activo) con el agregado de 0,5 ml.L-1 de Tween 20, seguido por tres enjuagues con agua destilada estéril. En la desinfección doble (DD), se procedió del mismo modo que en la DS pero luego de los enjuagues con agua destilada estéril, las semillas fueron dejadas en el agua del último enjuague durante 14 horas para su imbibición. Al día siguiente se realizó la segunda desinfección durante 15 minutos con una solución acuosa de ClONa (0,8% de cloro activo) con el agregado de 0,5 ml.L-1 de Tween 20, seguido por tres enjuagues con agua destilada estéril. Las semillas resultantes de cada tratamiento de desinfección se sembraron in vitro en medio con las sales y vitaminas MS (Murashige y Skoog, 1962) sin (MS) o con el agregado de 30 g L-1 de sacarosa (MSS). Los medios fueron ajustados a pH 5,8, se hicieron 8 g.L-1 en agar, esterilizados en autoclave y dispensados asépticamente en alícuotas de 25 mL en placas de Petri de policarbonato estériles. Se realizaron 3 tratamientos testigo sembrando las semillas en esterilidad sobre papel de filtro humedecido con agua destilada en placas de Petri: 1) Se sembraron semillas sin desinfectar lavadas 15 minutos bajo chorro de agua corriente y embebidas en agua destilada estéril por 14 horas antes de la siembra (P-D0), 2) semillas con desinfección simple (P-DS), y 3) semillas con desinfección doble (P-DD). Se sembraron 4 placas por cada uno de los 7 tratamientos con 25 semillas cada una. Las placas se distribuyeron al azar en cámara de cultivo a 25±3ºC con fotoperíodo de 16 horas (DFF: 48 umol.s-1.m-2). Al cabo de 7 días de cultivo se registró el número de semillas germinadas a fin de calcular la energía germinativa. A los 14 días se contó el número de semillas germinadas para obtener el poder germinativo, y a los 30 días se registró la contaminación y el peso fresco de las plántulas. Los datos se analizaron con el  ANOVA y el test de comparación de medias de Tukey al 5%. Resultados y Discusión En el primer conteo (energía germinativa), no se encontraron diferencias significativas entre el tratamiento con semillas no desinfectadas (P-D0) y los tratamientos con desinfección; tampoco entre los soportes (papel, MS y MSS) dentro de cada método de desinfección (tabla 1). A diferencia de lo descrito por Rosselló y colaboradores (2004) en H. tubispathus y por Piro (2007) para H. gracilifolius, en Z. filifolia no se encontró que la presencia de sacarosa en el medio retrasara la germinación a los 7 días en comparación con el medio sin sacarosa y con el testigo en papel (tabla 1). El poder germinativo en ninguno de los casos fue menor al 91%, valor muy aceptable para la obtención de explantos en la fase de establecimiento in vitro desde semillas de Z. filifolia. También es importante resaltar que la desinfección no afectó el poder germinativo al comparar cualquiera de los métodos y soportes con el testigo sin desinfectar (P-D0). Sin embargo, la desinfección sí afectó la biomasa de las plántulas, como se desprende de la comparación entre P-D0, P-DS y P-DD (Tabla 2). El soporte no afectó el poder germinativo independientemente del método de desinfección. Sin embargo, la doble desinfección en MS disminuyó significativamente (P<0,05) la germinación respecto de la simple desinfección (tabla 2). En este aspecto, también se puede observar una marcada diferencia en el comportamiento de Z. filifolia comparada con H. gracilifolius (Piro, 2007), debido a que el tratamiento de la doble desinfección para Habranthus no tuvo un efecto deprimente sobre la germinación en relación a la desinfección simple. Respecto a la eficiencia de desinfección, en todo el ensayo solo se encontraron cuatro semillas contaminadas, todas en la doble desinfección. El peso fresco de las plántulas fue significativamente mayor en los medios de cultivo con sacarosa, independientemente del método de desinfección empleado (tabla 2),muy probablemente debido al valor nutricional y energético de  la sacarosa. En los soportes de papel se obtuvo la menor biomasa, probablemente debido a la aparición de un déficit hídrico en este soporte como consecuencia de una provisión limitada en 30 días. No se encontraron diferencias entre los tratamientos con doble y simple desinfección (p>0,05). El medio que contenía sacarosa resultó ser el más apropiado para el establecimiento in vitro, ya que combinó un alto poder germinativo con las plántulas de mayor peso. Además, de existir una contaminación residual, este medio más rico permitiría evidenciarla. De las dos técnicas de desinfección, la más adecuada fue la de desinfección simple, debido a que tanto la energía como el poder germinativo fueron superiores, sumado a que se obtuvo una menor contaminación. En  la doble desinfección cualquier contaminación no controlada en el primer paso podría proliferar e introducirse en la semilla durante la imbibición y no ser eliminada en el segundo paso de desinfección. Piro (2007), observó que la técnica más apropiada para el establecimiento in vitro de Habranthus gracilifolius es la de doble desinfección utilizando medio de cultivo con sales y vitaminas MS con el agregado de sacarosa. Por otro lado, Rosselló y colaboradores (2004), concluyeron que, para el establecimiento in vitro de plántulas de Habranthus tubispathus a partir de semillas, el medio de cultivo más apropiado resultó ser el MS sin el agregado de sacarosa la cual inhibiría el crecimiento por choque osmótico. Asimismo esta tensión hídrica provocó que la energía germinativa y la biomasa fuesen menores, lo cual originó plántulas con menor peso fresco. En el caso de Z. robusta, Furmanowa y Oledzka (1983) lograron el establecimiento de plántulas utilizando como soporte papel. En nuestro caso el establecimiento in vitro se hizo sin el paso de la germinación en papel y así  se obtuvo un mayor tamaño de las plántulas y un menor riesgo de contaminación. Conclusiones Es posible el establecimiento libre de contaminación de microplantas de Zephyranthes filifolia a partir de una desinfección simple de sus  semillas y su posterior germinación y cultivo en medio MS conteniendo sacarosa. En futuros estudios, se prevee ensayar el cultivo in vitro de semillas de distinta procedencia, para evaluar la incidencia que tendría el medio ambiente sobre la contaminación, y en su caso  evaluar la necesidad de modificar el protocolo de desinfección para distintos lotes de semilla.   Tabla 1: Porcentaje promedio de energía germinativa (7 días de cultivo) y poder germinativo (14 días de cultivo) in vitro de semillas de Z. filifolia en medio con sales y vitaminas de MS en ausencia (MS) y presencia de sacarosa (MSS) y sobre papel humedecido (P), sin desinfección (D0), con desinfección simple (DS) y desinfección doble (DD). Letras distintas en cada fila indican diferencias entre medias por el test de Tukey. Soporte P MS MSS P MS MSS P Desinfección D0 DS DS DS DD DD DD Energía germinativa (%) 96 99 93 93 89 90 88 Tukey ab a ab ab ab ab b Poder germinativo (%) 96 99 99 96 91 94 91 Tukey ab a a ab b ab b   Tabla 2: Peso fresco medio de plántulas obtenidas mediante cultivo sobre papel humedecido (P) o in vitro en medio con las sales y vitaminas MS sin (MS) y con sacarosa (MSS), sin desinfección (D0), con desinfección simple (DS) y doble desinfección (DD). Letras distintas en cada fila indican diferencias entre las medias por el test de Tukey al 0,05 %. Soporte P MS MSS P MS MSS P