Ampliación de una colección de mutantes de inserción para la detección de genes que confieren tolerancia diferencial a la salinidad en alfalfa

FERNÁNDEZ, KARINA BEATRIZ; GÓMEZ,CRISTINA; AYUB, NICOLAS; SOTO, GABRIELA; JOZEFKOWICZ, CINTIA

San Carlos de Bariloche, Argengtina

Simposio; I SIMPOSIO DE CIENCIAS AGRARIAS DEL INTA-INNOVANDO CIENCIA: NUEVAS TECNOLOGÍAS APLICADAS AL MEJORAMIENTO GENÉTICO; 2022

INTA

Ampliación de una colección de mutantes de inserción para la detección de genes que confieran tolerancia diferencial a la salinidad en alfalfa. Introducción: La identificación y caracterización de los genes que regulan los mecanismos de tolerancia a salinidad es crucial para impulsar el desarrollo de futuras estrategias de mejoramiento genético en un cultivo de gran importancia económica a nivel mundial como es la alfalfa, cuyas características de ploidía (tetraploide) y tipo de fertilidad (alógama con fuerte depleción por endocría) no se corresponden con las características de otras especies modelo (tales como soja y M. truncatula). Objetivo: Ampliar una colección de líneas mutantes de Medicago sativa (alfalfa) por activación y transposición del retrotransposón Tnt1, a partir de líneas transgénicas (R1) que portan el retrotransposón Tnt1 en clones de afalfa (clones C2-3 y 423-19-17) que tienen buen comportamiento in vitro. A partir de estas líneas transgénicas primarias es posible la generación de una gran colección de mutantes de alfalfa, dado que sabemos que el retrotransposón Tnt1 se activa y transpone a nuevos sitios del genoma de alfalfa por pasaje por cultivo in vitro, tal como fue probado previamente (Jozefkowicz et al., 2021). En una segunda etapa, se realizarán ensayos de salinidad y se seleccionarán las líneas que presenten tolerancia diferencial. Finalmente, se identificarán los genes que participan de la regulación de los mecanismos de tolerancia a salinidad en alfalfa y que hayan sido reprimidos y/o sobre expresados por inserción del Tnt1. Métodos y resultados: Una vez confirmada la presencia del retrotransposón Tnt1 en las plantas transgénicas R1 que se utilizaron como material de partida, se indujo la activación y transposición del retrotransposón Tnt1 mediante embriogénesis somática indirecta. Con este fin se seleccionaron los folíolos más jóvenes de dichas plantas, se esterilizaron y se sembraron en medio MS (Murashige y Skoog) de inducción. Los explantos se mantuvieron en MS inducción en oscuridad durante un mes a 25 ºC, realizando un repique al mismo medio a los 15 días. Al cabo de un mes, los callos obtenidos se transfirieron a medio MS de regeneración y se mantuvieron en ese medio durante 30 días, obteniéndose a partir de éstos los embriones somáticos que se colocaron en medio MS mitad para enraizamiento. En este medio se realizaron repiques cada 20-30 días hasta obtener plántulas que se rustificaron en tierra. Hasta el momento se han logrado obtener 20 plántulas a las que se les determinará el número de inserciones del retrotransposón Tnt1 mediante Inverse PCR. Posteriormente, se comparará el número de inserciones del retrotransposón Tnt1 en las líneas transgénicas regeneradas (R2) en relación con las líneas transgénicas que se utilizaron como material de partida (R1). Por último, se realizarán ensayos de salinidad y se identificarán, mediante Inverse PCR seguida por secuenciación y análisis bioinformático, los genes que hayan sido reprimidos en su expresión y/o sobreexpresados por inserción del Tnt1, en las plantas R2 que muestren un fenotipo diferencial de tolerancia a salinidad. Conclusiones: En términos biotecnológicos esta plataforma representa una poderosa herramienta para la identificación de nuevos genes asociados a características agronómicas deseables en alfalfa, como ser una mayor tolerancia a la salinidad.