Ajuste de Microsatélites Anclados (ISSRs) en Lippia integrifolia.

IANNICELLI, JESICA; PÉREZ DE LA TORRE, MARIANA; ELECHOSA, MIGUEL; ESCANDÓN, ALEJANDRO SALVIO

San Salvador de Jujuy

Jornada; III Jornadas Nacionales de Plantas Aromáticas y sus Aceites Esenciales; 2012

Facultad de Ingeniería, Universidad nacional de Jujuy - PRONOA UNJu - INTA

Los marcadores moleculares son una poderosa herramienta para el estudio de la diversidad genética de poblaciones naturales, como complemento de los métodos morfométricos para la determinación de la distinguibilidad, uniformidad y estabilidad de las nuevas variedades y para el control de las colecciones de referencia. El objetivo de este trabajo es ajustar la técnica de ISSR en L. integrifolia para el estudio de sus poblaciones naturales. Se extrajo ADN a partir de hojas jóvenes mediante un método CTAB modificado. La concentración de ADN extraído se calculó por comparación sobre un mismo gel (agarosa 0,8% y 0.01% de bromuro de etidio), con cantidades conocidas del marcador de peso molecular λHind III. Para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se ajustaron, las temperaturas de anneling de 6 iniciadores ISSR. Las condiciones generales de reacción fueron: 30 ng de ADN molde, 2,5 µl e buffer de reacción 10X (500 mMKCl; 100 mM Tris?HCl, Ph9.0 a 25 °C; 1% Triton® X-100 sin Mg); 0,2 mM de dNTPs; 0,8 µM iniciadores y 0,5 U de Taq polimerasa (Inbio ? Highway); 3 mM de MgCl2; volumen final 25 µl, en termociclador BioRad (MyCycler). Las condiciones de ciclado fueron: (A) desnaturalización inicial de 10 min. a 94°C, (B) 40 ciclos de: 40 seg. a 94°C, 45 seg. a la temperatura de interés para cada iniciador y (C) extensión final por 10 min. a 72°C. El gradiente de temperatura de las reacciones (para cada uno de los iniciadores) se llevó a cabo usando como referencia la temperatura de hibridación teórica (Ta) de los iniciadores (Tm 4°C). Se probaron 6 temperaturas a partir de Ta para obtener finalmente la temperatura de uso (Tu). Los productos de PCR se corrieron en geles de agarosa al 1,5% en TAE 1X, teñidos en bromuro de etidio (0,05%). Una vez obtenida la temperatura óptima de los iniciadores, se procedió a ajustar la concentración adecuada de MgCl2 para 6 de los iniciadores, para lo cual se varió la concentración de MgCl2 entre 1,0 y 3,0 mM con una variación de 0,5 mM en cada punto del gradiente. Los productos de PCR se corrieron en geles de agarosa al 2% en TAE 1X, teñidos en bromuro de etidio (0,05%). Están en progreso el ajuste de las condiciones de PCR para 7 iniciadores más en esta especie.