EXPRESIÓN DE ZnT8 EN E. COLI Y SU APLICACIÓN EN UN INMUNOENSAYO NO RADIOMÉTRICO PARA EL DIAGNÓSTICO DE DIABETES MELLITUS AUTOINMUNE

SABLIJC, ADRIANA V; FACCINETTI, NATALIA I.; GUERRA, LUCIANO L.; BOMBICINO, SILVINA S.; IACONO, RUBÉN F.; POSKUS, EDGARDO; TRABUCCHI, ALDANA; VALDEZ, SILVINA N.

Buenos Aires

Jornada; VII Jornadas de Jóvenes Investigadores, Facultad de Ciencias Veterinarias; 2017

UBA

La diabetes mellitus (DM) tipo 1 es un trastorno autoinmune que se origina por una pérdida de la tolerancia hacia componentes propios de las células beta pancreáticas productoras de insulina, lo cual lleva a la destrucción de estas células por acción de los linfocitos T citotóxicos. La mayoría de los pacientes con reciente diagnóstico de DM tipo 1 tiene en circulación autoanticuerpos dirigidos contra diferentes antígenos de las células beta pancreáticas, entre los cuales se encuentran los que presentan especificidad hacia la isoforma 8 del transportador de Zn (ZnT8) específico de célula beta. La detección de autoanticuerpos dirigidos contra ZnT8 (ZnT8A), en combinación con los marcadores clásicos, permite incrementar la sensibilidad diagnóstica de autoinmunidad en pacientes con DM tipo 1 y en LADA (diabetes autoinmune latente del adulto).El objetivo del presente trabajo fue desarrollarun inmunoensayo no radiométrico para la detección de ZnT8A,empleando ZnT8 humano recombinante expresado en un sistema procariota de alto rendimiento. Un heterodímero del dominio C-terminal de ZnT8 (aa 268-369) formado por dos monómeros que difieren en el aminoácido de la posición 325, teniendo uno Arg y el otro Trpse expresó en E. coli(cepa GI724)como proteína de fusión con Tiorredoxina(TrxZnT8).La proteína de fusión se purificó por cromatografía de afinidad a partir de los cuerpos de inclusión.Empleando dicha proteína, se desarrollóun ELISA Doble Paratope con preincubación. Para la optimización del ensayo se emplearon 69 sueros humanos normales y 53 sueros de pacientes diabéticos tipo 1 (analizadas previamente por el método radiométrico de referencia).Para ello, se preincubódurante toda la noche a 4 ºCTrxZnT8-Biotina con los sueros bajo estudio; luego se incorporaron los preincubadossobreuna placa en la que se había inmovilizadoTrxZnT8. Así los anticuerpos presentes en el suero de los pacientes, se unieron a la TrxZnT8 inmovilizada en la placa de ELISA y a la TrxZnT8-Biotina soluble.Finalmente se detectó el inmunocomplejopor el agregado deavidina-peroxidasa.En cuanto a la producción de ZnT8 en E. coli se alcanzó un rendimiento de1,40 mg TrxZnT8/L cultivo con una pureza 96%. El ELISA desarrollado alcanzó una especificidad del 97% y una sensibilidad relativa al método de referencia del 58,5%, con señales de DO que fueron de 0.04 a 0.66, y una mediana de 0.29.En conclusión, se logró expresar eficientemente Trx-ZnT8en E. coli ydesarrollar un método de bajo costo, no radiométrico y ambientalmente inocuo para la evaluación de ZnT8A, fácilmente aplicable en laboratorios de mediana y baja complejidad operativa.