Expresión de ZnT8 en E. coli y su aplicación en el desarrollo de inmunoensayos no radiométricos para la detección de autoanticuerpos

FACCINETTI, NATALIA I.; GUERRA, LUCIANO L.; ROVITTO, BRUNO D.; SABLIJC, ADRIANA V; POSKUS, EDGARDO; TRABUCCHI, ALDANA; VALDEZ, SILVINA N.

Buenos Aires

Congreso; XX Congreso Argentino de Diabetes; 2016

Sociedad Argentina de Diabetes

Introducción: Los autoanticuerpos anti-transportador de Zinc 8 (ZnT8A) son específicos de célula beta y su detección, en combinación con los marcadores clásicos, incrementa la sensibilidad diagnóstica de autoinmunidad en pacientes con DM tipo 1 y en LADA.El objetivo del presente trabajo fue la expresión de ZnT8 recombinante en Escherichia coli y su aplicación en inmunensayos no radiométricos de alta sensibilidad y fácil ejecución para la detección de ZnT8A.Materiales y Métodos: La región C-terminal de ZnT8 fue clonada en el vector pTrxFus. Bacterias E. coli GI724 transformadas con pTrx-ZnT8, se cultivaron a 30oC y se indujeron con Triptófano 3 h a 37oC. La proteína de fusión TrxZnT8 se obtuvo de los cuerpos de inclusión (CI) y se purificó por afinidad, analizándose por SDS-PAGE y Western Blot (WB). Empleando dicha proteína se desarrollaron dos inmunoensayos:1) ELISA PRE-INCUBACIÓN: se incubó TrxZnT8-Biotina con los sueros estudiados, se separaron los inmunocomplejos con Porteína A-Sefarosa y se detectó el antígeno libre por captura en una placa inmovilizada con anticuerpos Anti-Trx.2) CITOMETRÍA DE FLUJO DOBLE PARATOPE: Se utilizaron microesferas de 4 µm inmovilizadas con TrxZnT8 como fase sólida, las cuales fueron incubadas con los sueros bajo estudio. Posteriormente se incubó con TrxZnT8-biotina y avidina?ficoeritrina, como reactivo revelador. Para la optimización de los inmunoensayos se emplearon 20 sueros de pacientes con DM tipo 1 y 22 sueros humanos normales (SHN). Los resultados obtenidos fueron comparados con los del método radiométrico de referencia (RBA).Resultados: El análisis por SDS-PAGE y WB reveló una banda de ~37.5 kDa, compatible con Trx-ZnT8 con un grado de pureza de 90%. Empleando el ELISA DE PRE-INCUBACIÓN se obtuvo una sensibilidad relativa al RBA del 40,0% (DM tipo 1, n=20) y una especificidad del 90,9% (SHN, n=22). Para la CITOMETRÍA DE FLUJO DOBLE PARATOPE los resultados se expresaron en Intensidad de Fluorescencia Media (IFM), arrojando valores de IFMmedia 6,2 y SD 1,3 para los SHN (n=6) mientras que los valores de IFM para los pacientes diabéticos fueron de 20,2, 16,1 y 9,4 (n=3).Conclusiones: Se logró expresar TrxZnT8 recombinante en E. coli correctamente plegada y con alto grado de pureza. Con dicha proteína se desarrollaron dos inmunoensayos; los resultados preliminares de los mismos factibilizan el análisis de un número mayor de muestras para establecer la performance de ambos inmunoensayos para su posterior aplicación.