Desarrollo de un inmunoensayo basado en citometría de flujo para la detección de marcadores de autoinmunidad en Diabetes Mellitus

GUERRA, LUCIANO L.; FACCINETTI, NATALIA I.; TRABUCCHI, ALDANA; IACONO, RUBÉN F.; POSKUS, EDGARDO; VALDEZ, SILVINA N.

Buenos Aires

Congreso; XVIII Congreso Argentino de Diabetes 2012; 2012

Sociedad Argentina de Diabetes

En Diabetes Mellitus (DM) autoinmune se generan autoanticuerpos (marcadores) contra distintos autoantígenos asociados a la agresión T-dependiente de las células β pancreáticas. El objetivo del trabajo consistió en la optimización de un inmunoensayo para la detección de anticuerpos (Ac) basado en Citometría de Flujo (CF), aplicable al apoyo diagnóstico en DM autoinmune. Se utilizaron microesferas de 2 y 4 µm sobre las que se adsorbieron Proinsulina (PI), Insulina (Ins) o Glutamato Decarboxilasa (GAD65). Para la optimización del sistema, éstas se incubaron con sueros policlonales de conejo específicos para PI o Cadenas A y B de Ins (CA y CB), o sueros de pacientes diabéticos con autoAc anti-GAD (GADA). Para la detección se utilizaron Ac anti-IgG de conejo-Fluoresceína o anti-IgG humana-Alexafluor 488. Se evaluó la presencia del inmunocomplejo en ensayos simples y combinados por CF (λexcitación = 488 nm). Las señales se obtuvieron en unidades de Intensidad de Fluorescencia Media (IFM) y los resultados se expresaron en Standard Deviation scores (sDS= (IFMsuero analizado-IFMmedia de controles normales)/Desvío Estándarcontroles normales). Se evidenciaron señales positivas para Ac anti-PI y anti-Ins en sueros de conejo cuando se evaluaron por separado como en la variante con determinación simultánea (tabla 1). Al analizar sueros humanos, se detectaron GADA en pacientes con DM autoinmune (tabla 2). Tabla 1. sDS para Ac anti-Ins y anti-PI en sueros de conejo ________________________________________________ Sueros Diseño Simple Diseño Múltiple_ _PI Ins PI Ins __ Preinmune -1,00 1,00 1,28 1,41 Anti-PI 600,24 3,46 142,91 8,03 Anti-CA 83,76 32,78 5,38 24,00 Anti-CB -1,95 36,06 -1,05 39,69 _ Tabla 2. sDS para GADA en sueros humanos _________________ Sueros sDS_ Normal 1,07 Paciente 1 17,58 Paciente 2 10,36 Paciente 3 5,71 Se logró desarrollar un inmunoensayo para detectar Ac empleando microesferas con detección fluorescente por CF. Se avanzó en la detección simultánea de Ac con especificidad diferente (mezcla de microesferas) y se pudo trasladar el modelo a la detección de GADA en sueros de pacientes con DM autoinmune, con la potencialidad de detectar simultáneamente los 4 marcadores de autoinmunidad.