Caracterización bioquímica de proinsulina recombinante mediante radiometría y resonancia plasmática de superficie

TRABUCCHI, ALDANA; GUERRA, LUCIANO L.; FACCINETTI, NATALIA I.; IACONO, RUBÉN F.; POSKUS, EDGARDO; VALDEZ, SILVINA N.

Buenos Aires, Argentina

Jornada; Jornadas de la Academia Nacional de Bioquímica; 2009

Academia Nacional de Bioquímica

CARACTERIZACIÓN INMUNOQUÍMICA DE PROINSULINA RECOMBINANTE MEDIANTE RADIOMETRÍA Y RESONANCIA PLASMÁTICA DE SUPERFICIE. Trabucchi, Aldana; Guerra, Luciano L.; Faccinetti, Natalia I.; Iacono, Ruben F.; Poskus, Edgardo; Valdez, Silvina N. Cátedra de Inmunología, Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA, e Instituto de estudios de la Inmunidad Humoral Prof. Ricardo A. Margni (IDEHU, CONICET-UBA)   El objetivo del trabajo fue la caracterización de proinsulina (PI) humana recombinante expresada en E.coli fusionada con tiorredoxina (Trx-PI) para el estudio de autoanticuerpos anti-PI (PAA) en pacientes con Diabetes Mellitus Autoinmune. La Trx-PI se obtuvo de la fracción soluble y se recuperó de los cuerpos de inclusión. Su inmunorreactividad se estudió por ensayo de inhibición usando sueros de pacientes diabéticos PAA+. Como control de calidad se realizaron curvas dosis-respuesta comparando Trx-PI con un estándar de PI (hPI) usando suero policlonal de conejo específico o sueros PAA+. Se analizaron los parámetros cinéticos de la interacción antígeno-anticuerpo mediante Resonancia Plasmática de Superficie (SPR). La Trx-PI recombinate se obtuvo con alto rendimiento y pureza. Los ensayos de competencia con Trx-PI 1uM disminuyeron los valores de  Score de Desvío Estándar (sDS) por debajo del valor de corte (sDS≤3,00). Las curvas dosis-respuesta  mostraron paralelismo entre Trx-PI y hPI. Los ensayos cinéticos SPR arrojaron valores de Ka  para el suero específico de 2,48x108M-1 para hPI y de 2,01x108M‑1 para Trx-PI. Conclusiones: Los ensayos inmunoquímicos usando sueros PAA+ y el comportamiento paralelo entre la Trx-PI y hPI en las curvas de desplazamiento, evidenciaron que la quimera retiene considerable inmunorreactividad asociada al motivo de proinsulina. Mediante SPR se logró determinar la Ka del suero policlonal específico frente Trx-PI y hPI, demostrando que es una herramienta aplicable al control de calidad de biomoléculas.