Modulação da biossíntese do ácido glucurônico em plantas de Nicotiana tabacum através da superexpressão do gene miox

CONTI, G; DEFÁVARI-NASCIMENTO, D; BERTOLO, ALF; GUTMANIS, G; LABATE, MTV; BRAGATTO, J; ODA, S; LABATE, CA

Foz do Iguaçu - Paraná - Brasil

Congreso; 52° Congresso Brasileiro de Genética; 2006

Sodiedade Brasileira de Genética

A Mio-Inositol Oxigenase (E.C. 1.13.99.1) é a enzima responsável pela biossíntese de ácido glucurônico, a través da oxidação do mio-inositol. O ácido glucurônico é um composto intermediário na rota metabólica de biossíntese de paredes celulares secundárias, particularmente na produção de componentes hemicelulôsicos. O objetivo do presente trabalho foi superexpressar o cDNA do gene miox, em plantas de Nicotiana tabacum. A seqüência do gene foi clonada em trabalhos anteriores desenvolvidos no laboratório, a partir de plantas de Arabidopsis thaliana. O cDNA obtido foi direcionalmente clonado no vetor pENTR/DTOPO ® e inserido, por transformação, em células TOP10 de Escherichia coli quimicamente competentes. As colônias recombinantes foram testadas por PCR e pelo seqüenciamento do DNA plastidial, com os primers universais M13, confirmando a presença do inserto de 974pb. Posteriormente, o cDNA foi clonado no vetor binário Gateway pK2WG7, com auxílio da enzima LR clonase, que catalizou uma reação de recombinação, sítio específico, entre os vetores pENTR-D TOPO recombinante e Gateway. O plasmídeo Gateway recombinante foi utilizado para transformar, via eletroporação, Agrobacterium tumefaciens EHA 105. As plantas de fumo foram transformadas por meio da técnica de infecção de discos foliares. Os discos foliares foram cultivados em meio de cultura MS enriquecido com os fitorreguladores ácido naftalenacético (NAA) e bensilaminopurina (BAP). Como agente seletivo foi utilizado o antibiótico canamicina. As plantas transgênicas foram cultivadas em casa de vegetação até a obtenção de sementes. As sementes foram coletadas e submetidas a testes de segregação da progênie em meio seletivo com canamicina, para encontrarmos proporções de germinação 3:1 que indicam a presença de uma cópia do gene no genoma da planta transgênica. As plantas segregantes 3:1 foram cultivadas em casa de vegetação. Suas sementes foram testadas novamente, visando a obtenção de genótipos não segregantes, o que indica homozigose. Os indivíduos homozigotos, pertencentes à segunda geração filial, foram submetidos a análises moleculares de Southern blot, utilizando uma sonda desenhada com base no gene nptII, de resistência à canamicina. Também foram realizados análises de Western blot, com anticorpos miox. Os resultados obtidos permitiram confirmar a presença do gene miox de A. thaliana no genoma das plantas de fumo, assim como a superexpressão do mesmo nas plantas transformadas. Serão apresentados também resultados das análises químicas para determinação dos carboidratos de parede, a fim de se avaliar o impacto da superexpressão do gene miox na composição dos polissacarídeos da parede celular. O conhecimento da regulação da expressão da enzima mio-inositol oxigenase em plantas, seria de grande utilidade para fornecer ferramentas de controle na biossíntese de polissacarídeos da parede celular.