Purificación de proteasas producidas por la mutante de Staphylococcus aureus RC128

M. L. TONELLI, I. WILL, C. RASPANTI, E. DUCRÓS, M. FERRARI Y C. BOGNI

”Recife, Brasil

Simposio; 15 Simposio SINAFERM; 2005

Las proteasas microbianas constituyen el grupo más importante de enzimas hidrolíticas y han sido estudiadas con el advenimiento de la enzimología. El interés en su estudio se debe no solo, por la importancia de las mismas en los procesos metabólicos celulares, sino también por su aplicación en la industria y en el desarrollo de agentes terapéuticos efectivos. Staphylococcus aureus es el principal agente etiológico de la mastitis bovina y la virulencia de este microorganismo se debe a la actividad coordinada genéticamente de varias toxinas y enzimas hidrolíticas, como así también a un gran número de proteínas sobre la superficie celular (Arvidson, S. y Tegmark (2001), Iandolo, J. (1989), Lowy, F. (1998)). Las proteasas excretadas por esta cepa son cuatro: serina proteasa (V8 proteasa: SspA), cisteína proteasa (SspB), metaloproteasa (aureolisina: Aur) y una segunda cisteína proteasa (Scp: estafopaína) (Drapeau G.,y otros, (1972), Karlsson A. y Arvidsson S. (2002).). El grupo de investigación del laboratorio de Genética Microbiana de la UNRC aborda desde 1986 la problemática de la mastitis bovina en la región, a través del control de la enfermedad mediante el desarrollo de cepas vacunales y del estudio de aspectos fisiológicos, genéticos y epidemiológicos de cepas de S. aureus y de Streptococcus sp. Bogni, C. y otros.(1997), Bogni, C. y otros (1998)., Calzolari A. y otros. (1997). En este laboratorio se aislaron y caracterizaron dos mutantes insercionales, designadas RC 108 y RC 128, las que exhiben alteraciones en la producción de varias exoproteínas, en particular de proteasas en distintas condiciones de cultivo (Giraudo, A. y otros (1994), Martinez, G. (1997) Príncipe, Analía. (2001).). La mutante RC 128 evidenció una marcada actividad proteolítica tanto en condiciones in vitro como in vivo (Martinez, G. (1997)), por lo tanto resulta de interés la investigación de nuevas proteasas y su posible aplicación tanto en el área industrial como también el uso de tales enzimas “per se” en la terapia de la mastitis, una de las enfermedades infecciosas más importantes que afectan al ganado bovino lechero, evitando así los típicos problemas de resistencia a drogas de los antibióticos clásicos. El objetivo del presente trabajo es implementar técnicas para la purificación y caracterización parcial de las proteasas presentes en sobrenadantes de cultivos de la cepa mutante Staphylococcus  aureus RC 128. MATERIALES Y MÉTODOS Cepa y Condiciones de cultivo: Se empleó una cepa mutante insercional sax::Tn925 aislada y caracterizada en el laboratorio de Genética Microbiana de la UNRC, designada Staphylococcus aureus RC128, resistente a tetraciclina (Tcr). Esta cepa deriva de la cepa salvaje S. aureus RC108, aislada de un caso de mastitis subclínica bovina [42]. Se realizó un precultivo de la cepa de S.aureus RC128 en 125 ml de caldo BHI y se incubó a 37 ºC, con una agitación de 250 r.p.m. durante 8 hs. Luego, este cultivo se empleó para sembrar 1000 ml de caldo BHI y se incubó en las mismas condiciones que el precultivo durante 15-16 hs. Purificación de la proteasa Precipitación con Sulfato de amonio El cultivo previamente descrito se centrifugó a 5000 r.p.m. durante 25 minutos a 4 ºC y el sobrenadante  y el sobrenadante se precipitó con sulfato de amonio al 75% [43] de saturación, El precipitado se separó del sobrenadante por centrifugación a 5000 rpm durante 25 minutos, a 4 ºC y se resuspendió en 20 ml de buffer Tris-HCl 0,01 M (pH 6,6). Un volumen de 18 ml de esta solución se dializó contra el mismo buffer, con agitación a 4 ºC [3] durante 18-20 hs. Cromatografica de intercambio iónico Con el objeto de separar las proteínas presentes en el dializado, se utilizó una columna cromatográfica de intercambio aniónico DEAE-Sepharosa (15 cm x 1 cm),, que tiene la propiedad de retener moléculas con carga negativa. La elución se realizó con NaCl disuelto en  buffer Tris-HCl 0,01 M (pH 6,6) y en las siguientes concentraciones: 0 M, 0,5 M, 0,65 M, 0,75 M, 0,85 M y 1 M. Un volumen de 3 ml de dializado se introdujo en la columna y se conectó secuencialmente a los recipientes conteniendo el buffer Tris-HCl 0,01 M (pH 6,6) con los diferentes gradientes Métodos analíticos Actividad proteolítica Técnica de azocaseína: se midió usando azocaseína como sustrato. A 600 ml de las fracciones purificadas se le agregaron 1.600 ml de azocaseína al 0.3% (sustrato) en buffer Tris-salino pH 7.4. Se incubó en baño a 45ºC durante 1hr. Luego, se adicionaron 800 ml de ácido tricloroacético al 10% (p/v) para detener la reacción. Seguidamente se centrifugó durante 25 minutos a 4º C y 5000 rpm y se midió la absorbancia (OD) a 340 nm en  espectrofotómetro. Una unidad de actividad proteolítica (UP), fue definida como el incremento de 0.1 unidades de absorbancia a 340 nm después de una hora de incubación a 45ºC. Detección en Agar-Caseína: fue determinada mediante siembra de 30 μl de cada fracción en orificios dentro del agar e incubada 24 hs a 37 ºC. La presencia de un halo de precipitación blanco alrededor de los pocillos se consideró como evidencia de actividad proteolítica. Electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE)-gelatina: las proteínas concentradas se analizaron en geles de poliacrilamida al 12% (SDS-PAGE) copolimerizada con 0,1% de gelatina. Los geles se prepararon de acuerdo al sistema de buffer discontinuo desarrollado por Laemmli [47]. Determinación de proteína El contenido en proteína de las muestras se determinó de acuerdo al protocolo de Bradford (1976). A 100 ml de las fracciones purificadas se le agregó 1 ml del reactivo. Se incubó 5 min. a tempertatura ambiente y luego se midió absorbancia a 595 nm empleándose albúmina sérica bovina como estandar. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Purificación de las Proteasas Las proteasas se purificaron a partir del sobrenadante del cultivo de la cepa S. aureus RC128 mediante etapas secuenciales de precipitación con sulfato de amonio, diálisis y cromatografía de intercambio iónico sobre DEAE-Sepharose. La recuperación y la pureza de las proteínas con actividad proteolítica parcialmente purificadas se muestran en la tabla 1 En la figura 1 se representan los perfiles de elución de las proteasas de la columna cromatográfica DEAE-Sepharose. La curva que corresponde a la concentración de proteínas (mg/ml), si bien muestra dos picos diferentes, sólo el eluído en el gradiente 0,65 y 0,75 M de NaCl, presentó actividad proteolítica, la cual fue determinada mediante la técnica de azocaseína. Para determinar la actividad proteolítica total en las distintas fracciones de la columna DEAE-Sepharose, se calculó el área bajo la curva de actividad proteolítica (UP/ml) en función de los volumenes recogidos, obteniéndose un valor de 84,50 UP. El mismo procedimiento se utilizó para calcular la proteína total en las distintas fracciones de la columna cromatográfica, oteniéndose un valor de 0,18 mg. Actividad Proteolíca Se determinó la presencia de exoproteínas con actividad proteolítica para la cepa S. aureus RC128 en el medio Agar-Caseína. La caseína es frecuentemente usada como sustrato para determinar actividad proteolítica, dado que es facilmente manipulable y estable bajo condiciones de conservación. Debido a su compleja composición y estructura, este sustrato sufre proteólisis con todas las enzimas proteolíticas sin previa desnaturalización [50].  Los resultados obtenidos se muestran en la figura 2, donde se observan halos de precipitación alrededor  de los orificios de siembra correspondientes a las siguientes muestras: sobrenadante, precipitado, dializado y sólo en las fracciones 12 y 15 de las distintas ensayadas. Estos resultados coinciden con los obtenidos mediante la aplicación de la técnica de azocaseína. Con el objetivo de determinar la actividad proteolítica, las muestras de las diferentes etapas de purificación se sembraron en geles de poliacrilamida copolimerizada con gelatina. En la figura 3 puede observarse la presencia de tres bandas con actividad proteolítica en el sobrenadante, precipitado y dializado, cuyos pesos moleculares se estimaron en 34,7 kDa, 28,4 kDa y 20,8 kDa respectivamente, mientras que en las fracciones 3 a 11 sólo se detectaron dos bandas, la de mayor y menor peso molecular. Por otra parte, en la fracción 12 se observan las tres bandas nuevamente. Finalmente, en las fracciones 15 a 24 aparecen sólo dos bandas, la de mayor y menor peso molecular. El valor de actividad proteolítica de la fracción 12 obtenido con la técnica de azocaseína y la presencia de la banda de 28,4 kDa en el gel, indicarían que ésta, sería la que contribuye mayoritariamente a la actividad proteolítica total. Caracterización parcial de las proteasas A los efectos  de determinar la presencia de distintos tipos de proteasas parcialmente purificadas del sobrenadante del cultivo de la cepa de S. aureus RC128, se realizaron experimentos que consistieron en la adición de diferentes tipos de inhibidores específicos de proteasas. Los resultados de este ensayo se muestran en la tabla 6. La actividad proteolítica fue totalmente inhibida por PMSF, inhibidor específico de serina-proteasas, además, EDTA y 1,10-fenantrolina, inhibidores específicos de metalo-proteasas, inhibieron el 78,7% y 68,6% de la actividad respectivamente. Finalmente, E-64, un conocido inhibidor de cisteína-proteasas, inhibió un 94,4% de la actividad. Tabla 6. Efecto de inhibidores específicos de proteasas sobre las proteasas parcialmente purificadas de S. aureus RC128. Estos resultados indicarían la presencia de dos clases de proteasas extracelulares: metalo y serina-proteasas, encontrándose esta última en mayor proporción. La implementación de las distintas técnicas para determinar actividad proteolítica y el uso de inhibidores específicos, permitió estudiar los diferentes tipos de proteasas producidas por S. aureus RC128. Los resultados obtenidos sugieren que la banda de 28,4 kDa detectada en el gel de poliacilamida-gelatina, correspondería a una serina-proteasa.