“Importancia de la Asparagina 879 en la formación del sitio de unión para el Ca2+ del transportador de Calcio de membranas plasmáticas humanas.”

DÉBORA E. RINALDI.; HUGO P. ADAMO

Mar del Plata. Argentina

Congreso; CONGRESO CONJUNTO DE SOCIEDADES BIOMÉDICAS; 2004

Sociedad Argentina de Biofísica

El transportador de Ca2+ de membrana plasmática o PMCA es responsable de la expulsión del Ca2+ con alta afinidad desde el citosol de células eucariotas al medio extracelular. Es una ATPasa del grupo P que comprende las ATPasas transportadoras de iones que forman una fosfoenzima mediante la unión covalente con el fosfato-g del ATP. Estudios previos sugieren que en la PMCA, en analogía con la SERCA o Ca2+ ATPasa del retículo endoplásmico, la asparagina 879 en el segmento transmembránico 6, es uno de los residuos que forman el sitio de unión del Ca2+. Con el objetivo de establecer la importancia de la asparagina 879 en la formación del sitio para el Ca2+ se obtuvo por mutagénesis dirigida un ADN que codifica la isoforma humana 4xb de la PMCA conteniendo la substitución de la asparagina 879 por aspartato (N879D). Resultados anteriores de nuestro laboratorio (Bredeston, L.M. y Adamo, H.P. 2004) mostraron que la mutación del residuo aspártico 170 por asparagina (D170N) genera una forma activada de la PMCA. Por este motivo se construyó además una mutante doble conteniendo los cambios N879D y D170N. Se utilizó un sistema de expresión de levaduras para la producción de PMCA recombinante. Células de Saccharomyces cerevisiae DBY2062 fueron transformadas con el vector pMP 625 conteniendo el gen de la hPMCA4xb N879D bajo el control de un promotor PMA1 fuerte. Se seleccionaron las levaduras transformantes y se aislaron las membranas celulares. La reactividad con anticuerpos anti PMCA indicó que ambas proteínas mutantes fueron expresadas a niveles similares a los de la proteína salvaje. Los resultados muestran que es posible expresar en levaduras mutantes del transportador de Ca2+ de membrana plasmática humana conteniendo la substitución individual o conjunta de D170N y N879D , y sugieren que estos cambios no afectan la relación entre síntesis y degradación de la PMCA.