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IntroducciónLas enfermedades autoinmunes sistémicas son un grupo de patologías también conocidas como enfermedades del tejido conectivo o enfermedades autoinmunes reumáticas. Este grupo de enfermedades incluye el Lupus Eritematoso (LE), en sus distintas variantes, el Síndrome de Sjögren (SS), la Artritis Reumatoidea (AR) y otras menos frecuentes como la dermato/polimiositis y la esclerodermia. Una de las características principales de las patologías mencionadas es la presencia de autoanticuerpos contra distintos antígenos nucleares en el suero de los pacientes. Dentro de los antígenos nucleares reconocidos se encuentra el ADN simple y doble cadena (reconocido principalmente en el Lupus), proteínas asociadas al ADN como las histonas o la ADN topoisomerasa I y complejos mixtos de proteínas y moléculas de ARN (no codificante) denominadas ribonucleoproteínas (RNP). Dentro de estos últimos autoantígenos se destacan las pequeñas RNP nucleares (small nuclear RNP o snRNP) compuestas por el antígeno Sm (formado por 7 polipéptidos) y una molécula de ARN (U1, U2, U4/U6 o U5); las RNP nucleares (nRNP) y, por último, el complejo RoRNP que se encuentra formado por dos proteínas (Ro/SS-A 60 y La/SS-B) que interaccionan directamente con una molécula de ARN (hYRNA) y una tercer proteína (Ro/SS-A 52) que interactúa con el complejo a través de la proteína Ro/SS-A 60. Las 2 proteínas Ro/SS-A (52 y 60) son reconocidas por autoanticuerpos con alta incidencia en SS 1º y en menor proporción en pacientes con SS 2º, LES y AR.Dentro de las manifestaciones clínicas más comunes de los pacientes con LES se encuentra la fotosensibilidad cutánea (FC), caracterizada por una reacción inflamatoria exacerbada luego de exposiciones cortas a la luz solar. El mecanismo propuesto para el desarrollo de esta reacción inflamatoria involucra la relocalización desde el núcleo hacia la membrana plasmática de los autoantígenos Ro/SS-A durante los procesos de muerte celular por apoptosis de queratinocitos luego de exposición a radiación UV. Esta relocalización permite que una célula apoptótica (que no genera inflamación del tejido) sea reconocida por los autoanticuerpos anti-Ro/SS-A circulantes y desencadene una reacción inflamatoria. Sin embargo, los pacientes con SS 1º no presentan FC, a pesar de poseer altos niveles de autoanticuerpos anti-Ro/SS-A. Si bien existe mucha controversia sobre la hipótesis del mecanismo de desarrollo de la FC, no existen trabajos realizados con los autoanticuerpos anti-Ro/SS-A aislados, si no con sueros de pacientes con diferentes patologías.El objetivo del presente trabajo es purificar los autoanticuerpos anti-Ro/SS-A 52 y 60 (individualmente) a partir de pacientes con diferentes patologías autoinmunes sistémicas seleccionados previamente.Materiales y MétodosLos sueros de pacientes fueron remitidos por el servicio de Reumatología del Hospital de Clínicas José de San Martín, donde, además, se registraron las manifestaciones clínicas de los pacientes. Sobre un total de 184 pacientes (sobre los que se estudió el nivel de autoanticuerpos y su relación con la FC) se seleccionaron para la purificación de anticuerpos 10 pacientes con las siguientes características:Todos Ro/SS-A 52 y 60 +Fotosensibilidad +:2 LES, 2 SS 2º LES, 1 LESFotosensibilidad -: 1 SS 2º LES, 2 SS 2º AR, 2 SS 1ºPara la purificación de los autoanticuerpos se utilizaron las proteínas recombinantes humanas Ro/SS-A 52 y 60, expresadas individualmente en E. coli BL21 pLys utilizando un plásmido pET 22b. Las proteínas fueron purificadas a través de su cola de histidina con una matriz de Sepharosa-Niquel. Una vez purificadas fueron unidas covalentemente a una matriz de Sepharosa activada con bromuro de cianógeno (1 ml), cuyos sitios activos remanentes fueron bloqueados con glicina (Gly).Para la purificación se sembró el suero diluido en PBS, se realizaron 3 lavados de 4 ml con PBS; luego 4 lavados de 2 ml con PBS+0.5 M ClNa y finalmente se realizó la elución de los autoanticuerpos en 2 condiciones sucesivas: la primera con Gly-ClH 0.15M ClNa 1M pH 3.5 y la siguiente con el mismo buffer pero de pH 2.7. Las muestras de eluído fueron colectadas sobre 0.1 ml de Tris 1M pH 8.5 para neutralizar inmediatamente el pH ácido.Todas las muestras fueron analizadas por ELISA utilizando las proteínas recombinantes Ro/SS-A 52 y 60 purificadas (individualmente) como antígenos.ResultadosSe purificaron exitosamente los autoanticuerpos anti-Ro/SS-A 52 y anti-Ro/SS-A 60 en todos los pacientes seleccionados. La eficiencia del proceso de purificación se determinó mediante el descenso en el título de autoanticuerpos por ELISA en los sueros pre y post-purificación. Para el antígeno Ro/SS-A 52 fue necesario recurrir a una recromatografía del suero en 3 de los 10 sueros purificados, mientras que para el antígeno Ro/SS-A 60 fue necesario recromatografiar 4 sueros.Los autoanticuerpos purificados se encontraron mayoritariamente en el eluído de pH 3.5, mientras que sólo en aquellos sueros de alto título se pude evidenciar la presencia de anticuerpos en el eluído de pH 2.7. Para todos los autoanticuerpos purificados se observó que no existe reacción cruzada entre los antígenos Ro/SS-A, demostrando también de esta forma la eficiencia del proceso de purificación.ConclusionesLa purificación de autoanticuerpos a partir del suero de pacientes con diferentes patologías autoinmunes sistémicas fue efectiva. Es posible purificar los anticuerpos y mantener su actividad bioloógica, aún después de una elución ácida. Sin embargo, en aquellos sueros de muy alto título contra los antígenos Ro/SS-A 52 y 60 no fue suficiente con un único ciclo de purificación, si no que fue necesario recromatografiar la muestra para lograr una purificación apropiada.Los autoanticuerpos purificados serán utilizados en estudios posteriores para poder determinar si juegan un rol importante en los mecanismos de desencadenamiento de la fotosensibilidad cutánea.

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