Cultivo primario de condrocitos articulares de rata y estudio de su respuesta frente a estímulos inflamatorios

ELIANA CELA; MARIELA L. PAZ; FEDERICO S. WEILL; DANIEL H. GONZÁLEZ MAGLIO; ALEJANDRO FERRARI; JULIANA LEONI

Buenos Aires, Argentina

Simposio; Avances en Inmunología Básica y Aplicada: de la mesada a la clínica; 2008

Nacional de Farmacia y Bioquímica

Introducción:La osteoartritis es una enfermedad degenerativa del cartílago de las articulaciones y forma parte de un grupo de enfermedades reumáticas que afectan en mayor medida a individuos adultos. Una de las principales clases de células afectadas e involucradas en el proceso degenerativo son los condrocitos, presentes en el cartílago y encargados de producir y mantener la matriz cartilaginosa. Éstas células participan en la generación del daño produciendo mediadores inflamatorios tales como IL-6 y óxido nítrico (NO) frente a diferentes estímulos, como por ejemplo citoquinas liberadas por LT (IL-1), o componentes bacterianos (LPS). Como consecuencia del daño inflamatorio, disminuye la síntesis de cartílago y aumenta su degradación. El establecimiento de un modelo in vitro que permita el análisis de los mediadores inflamatorios que participan de dicho proceso (como la IL-6 y el NO) es de suma importancia, ya que facilitaría el estudio de posibles blancos farmacológicos. En este contexto, el objetivo del presente trabajo es establecer un modelo animal de cultivo primario, que permita evaluar la repuesta inflamatoria de los condrocitos articulares de rata frente a dos estímulos bioquímicos (IL-1 y LPS). Métodos: El estudio de la respuesta inflamatoria, se realizó sobre un cultivo primario de condrocitos de articulación de rata. Se emplearon 4 ratas (2 machos y 2 hembras), las cuales fueron sacrificadas por administración intraperitoneal de ketamina y xylazina, seguida de eutanasia por CO2. El procedimiento de obtención de condrocitos consistió en la apertura quirúrgica de los miembros posteriores, luxación de la articulación y sección del cartílago superficial de la cabeza femoral y tibial. Los fragmentos de tejido así obtenidos fueron luego incubados primero con PBS-tripsina 0.15% (1 h), y luego con PBS-colagenasa 0.15% (24 hs). A continuación, las células obtenidas fueron lavadas con medio fresco, y plaqueadas en botellas de cultivo con medio de cultivo MC1 (HAMF10 + DMEM + 10%SFB + ATB-ATM) hasta confluencia.Como estímulos inflamatorios se utilizaron LPS de E.coli e IL-1 de rata, en distintas concentraciones. Se tomaron muestras a distintos tiempos post-estímulo y se evaluó la presencia de los mediadores inflamatorios (IL-6 y nitritos totales) en el sobrenadante de cultivo. La determinación de IL-6 se realizó mediante la técnica de ELISA, y la de nitritos, por la técnica de Griess. Resultados: El estímulo con IL-1 fue efectivo, ya que se logró una producción de IL-6 mayor al basal. El máximo de concentración de IL-6, 9350 pg/ml, se consiguió con una concentración de IL-1 de 100 pg/ml. El LPS produjo una respuesta mucho mayor, observándose niveles de IL-6 máximos (43500 pg/ml) a una concentración de LPS de 4 mg/ml. Como en el primer ensayo todas las concentraciones de LPS produjeron un aumento significativo de los valores de IL-6, se realizó un barrido de concentraciones aún mayor (10-6 - 103 ng/ml) y se midió la producción de IL-6 a las 24, 48 y 72 hs post-estímulo. Se observó un notable aumento de IL-6  a las 48 y 72 hs respecto del obtenido a las 24 hs. Para realizar la evaluación de la producción de nitritos, los condrocitos fueron tratados con las dosis más elevadas de IL-1 (100 pg/ml) y de LPS (4 mg/ml). En estas condiciones los niveles de nitritos en el sobrenadante de células sin estimular y estimuladas con IL-1 no fue detectable, mientras que se incrementaron muy levemente en las células tratadas con LPS. Conclusiones: Se logró establecer el cultivo primario de condrocitos articulares de rata. Estas células permanecen viables (y responden al estímulo) durante un número de pasajes (5) que permite su uso como modelo in vitro. Además, se vio que responden a LPS e IL-1 en forma dosis dependiente. En estas condiciones la producción de nitritos esta por debajo de los límites de detección de la técnica utilizada. Los resultados de este trabajo indican que este modelo podrá ser utilizado para el estudio de terapias antiinflamatorias articulares in vitro.