Estandarización de la técnica de cría in vitro de abejas obreras

CANO TRIANA, DERLY XIOMARA; MANZOLI, DARÍO E.; JUNGES, CELINA MARÍA

Esperanza, Santa Fe

Jornada; JORNADAS DE DIFUSIÓN DE LA INVESTIGACIÓN Y EXTENSIÓN; 2022

Estandarización de la técnica de cría in vitro de abejas obrerasA nivel mundial, las colonias de abejas domésticas (Apis mellifera) están sometidas a la exposición simultánea y multifactorial de estresores que están provocando declinaciones alarmantes en sus poblaciones. La contribución individual o combinada de los estresores es prácticamente imposible de predecir a través de experimentos en colonias (in vivo), debido a que los resultados pueden estar sesgados por una gran cantidad de factores no controlados. En la actualidad, los experimentos con cría de abejas bajo condiciones controladas de laboratorio (in vitro) se han convertido en una herramienta cada vez más utilizada como fuente de información para evaluar el impacto de estresores internos (microambiente) y externos (macroambiente) a las colonias de abejas que tienen influencia sobre su salud. Tasas de éxito variables en la supervivencia de las abejas inmaduras, en los tiempos de emergencia y en la reproducibilidad de los procedimientos fueron observadas en diferentes protocolos de crianza in vitro, siendo las principales causas de la variación observada las habilidades prácticas del operador, la temporada, la variación genética y la heterogeneidad de la edad de las larvas en el momento del injerto. Conforme a lo señalado anteriormente, el presente trabajo tiene como objetivo estandarizar los procedimientos de cría in vitro de abejas obreras (A. mellifera) a fin de garantizar la validez de la técnica y la calidad de los resultados.Para el estudio se seleccionaron tres colonias de abejas domésticas, genéticamente diferentes y libres de enfermedades, alojadas en colmenas Langstroth dentro del apiario de la Escuela de Agricultura, Ganadería y Granja (Esperanza, Santa Fe, Argentina). Los experimentos fueron realizados de noviembre a diciembre de 2021 y de enero a febrero de 2022. Para obtener una cohorte de crías con edad aproximadamente conocida, cada reina fue confinada en su propia colonia e invitada a oviponer durante 24 hs dentro de un cuadro técnico con un marco labrado en su interior. Luego de verificar la presencia de huevos, cada reina fue liberada. A los tres días, los marcos con larvas recién nacidas (< 12 hs de edad) se trasladaron al laboratorio en un recipiente aislado para evitar variaciones de temperatura. Una vez en el laboratorio, se trabajó dentro de una cabina de extracción desinfectada, donde se transfirieron 96 larvas en el primer estadio (L1) de cada colonia (~6,5 % de la cohorte) desde el panal hacia celdas de plástico con una aguja de traslarve de acero inoxidable (tipo alemana), ubicadas todas dentro de los pocillos de una placa de cultivo de 48 wells. De esta forma se generaron 3 réplicas en noviembre-diciembre y 3 en enero-febrero.Las larvas fueron criadas dentro de un desecador y a su vez dentro de una incubadora con temperatura (34,5°C) y humedad relativa constantes dentro del desecador (~90% o 75% HR, según corresponda) hasta completar el desarrollo pupal y posterior emergencia del imago. Las larvas se alimentaron con una dieta artificial compuesta de jalea real, glucosa, fructosa y extracto de levadura en agua destilada estéril, administrada en volumen creciente: 20 μl antes de la transferencia, 20 μl a las 48 hs, 30 μl a las 72 hs, 40 μl a las 96 hs, y 50 μl a las 120 hs durante el período de alimentación1. Diariamente se revisó la supervivencia de cada cohorte de crías. Una larva se clasificó como muerta cuando su color cambió a marrón o permaneció inmóvil, y una pre-pupa o pupa fue clasificada como muerta cuando su pigmentación fue inusual o su cutícula perdió turgencia2. Durante todo el período de crecimiento, y para prevenir la contaminación bacteriana o fúngica, se descartaron los cadáveres diarios de cría. La tasa de sobrevida de larvas, pupas y abejas adultas se calculó mediante la ecuación: (número total de individuos que completan la etapa de vida/número total de individuos que ingresan a la etapa de vida) × 100. Estos datos se contrastaron con los establecidos por la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico (OECD), que indica que la mortalidad de larvas (definida como la mortalidad acumulada entre los días 3 y 8) debe ser menor al 15% y la emergencia de los adultos debe ser mayor al 70% para todas las réplicas4 La comparación de mortalidad de larvas y emergencia de adultos entre las réplicas y entre éstas y los establecidos por la OECD, se realizó mediante la prueba de Chi cuadrado a través del programa estadístico R3. De acuerdo con los resultados obtenidos, no se observaron diferencias de mortalidad entre los días 3 y 8 días entre las réplicas de noviembre y diciembre (p-valor: 0,85) y entre las de enero y febrero (p-valor: 0,89). Tampoco se han observado diferencias entre ambos grupos (p-valor: 0,63). Sí se puede observar que, tal como lo sugiere la OECD4, la mortalidad en todas las réplicas fue menor al 15% (p-valorNov-Dic < 0,0001 para noviembre-diciembre y p-valorEnero-Febrero < 0,0001 para enero-febrero) (fig. 1A).Al analizar la emergencia de adultos, en este estudio piloto se observó que no hubo diferencias entre las réplicas de noviembre-diciembre (p-valor: 0.97), ni entre las de enero-febrero (p-valor: 0.67), como tampoco se observaron diferencias entre ambos grupos (p-valor: 0,42). Todas las réplicas mostraron un valor de emergencia de adultos mayor al 70% (valor umbral establecido por la OECD), esto se observó tanto para noviembre-diciembre (p-valor < 0,0001) como en enero-febrero (p-valor < 0.0001) (fig. 1B). Con estos resultados, podemos concluir que el procedimiento de cría in vitro puede ser implementado como protocolo estándar para cría de abejas. Resta determinar si este contexto de cría tiene algún impacto sobre el peso y el tamaño de las larvas y las obreras adultas recién emergidas.