Identificación y evaluación de potenciales inhibidores de flavoproteínas de Xanthomonas citri subsp. citri

MOYANO, LAURA; PETROCELLI, SILVANA; TONDO, M. LAURA; VELÁZQUEZ-CAMPOY, ADRIÁN; SANCHO, JAVIER; MARTÍNEZ-JÚLVEZ, MARTA; MEDINA, MILAGROS; ORELLANO, ELENA G.

Rosario

Congreso; XXIII Congreso Latinoamericano de Microbiología y XIV Congreso Argentino de Microbiología (ALAM-AAM); 2016

El cribado de alto rendimiento (High-ThroughputScreening) consiste en ensayar de forma masiva la unión o la inhibición de un gran número de compuestos a una proteína diana específica a través de la medición de alguna propiedad de la proteína. El uso de quimiotecas ha permitido el descubrimiento de inhibidores específicos, los cuales podrían utilizarse como potenciales agentes terapéuticos contra la infección por Helicobacter pylori y Leishmania mexicana.Xanthomonas citrisubsp. citri (Xcc) es el agente causal de la cancrosis de los cítricos, una de las enfermedades más severas que afecta al género Citrus. En trabajos previos realizados en nuestro laboratorio se han estudiado flavoproteínas con funciones importantes en Xcc,entre las que se encuentran fotorreceptores de luz azul como LOV y BLUF, y la Ferredoxina-NADP Reductasa (FPR). El objetivo del presente trabajo es la búsqueda de inhibidores de flavoproteínasde Xcc para el control de la cancrosis de los cítricos utilizando quimiotecas comerciales.Se realizó el cribado de alto rendimiento de dos quimiotecas, una de 1120 compuestos (PrestwickChemical Library) para la proteína XccLOVy otra de 10000 compuestos (Maybridge-Hitfinder) para las proteínasXccLOV y XccFPR. Para ello se monitoreó el desplazamiento de la estabilidad térmica de la proteína XccLOVrecombinante en presenciade cada uno de los compuestos presentes en las quimiotecas.Se calcularon las Tm promedio y los desvíos estándar (ds) correspondientes a los controles de cada placa y se compararon con los valores de Tm obtenidos de los pocillos que contenían cada uno de los compuestos. Aquellos compuestos que causaron una disminución de la Tm de la proteína de al menos 2 ds con respecto a los controles fueron considerados como posibles desestabilizadores de las proteínas.El cribado de la proteína XccFPR se realizó mediante inhibición de la actividad diaforasa. Para la proteína XccLOV se encontraron 20 compuestos en la quimioteca de Prestwicky 8 compuestos de la quimioteca de Maybridge,que serían posibles inhibidores de la actividad de esta proteína. Se seleccionaron 3 compuestos de la primer quimioteca para comenzar con los ensayos de inhibición del crecimiento bacteriano.Por otra parte, se detectaron 43 potenciales inhibidores deXccFPR en la quimioteca deMaybridge y se analizó el efecto de los mismos de forma individual sobre la proteína XccFPR mediante el ensayo de actividad diaforasa. Se seleccionaron 4 compuestos para realizar los ensayos de inhibición del crecimiento bacteriano. Dos los compuestos inhibidores de XccLOV seleccionados mostraron inhibición del crecimiento de Xcc en placas de medio sólido. Estos compuestos presentaron actividad bactericida cuando se realizaron los ensayos de crecimiento de Xcc en medio líquido. De los 4 compuestos inhibidores de XccFPR sólo 2 mostraron inhibición del crecimiento bacteriano en medio sólido. Estos compuestos inhibidores del crecimiento de Xcc podrían ser potenciales agentes bactericidas para el tratamiento de la cancrosis de los cítricos.