EVALUACIÓN DE APTÁMEROS ESPECÍFICOS CONTRA LA PROTEÍNA DE LA NUCLEOCÁPSIDE (N) DE SARS-COV-2 PARA EL DESARROLLO DE UN TEST RÁPIDO DE DETECCIÓN DE LA INFECCIÓN

JULIETA GARCIA REY; AGUSTINA CERRI; ANA LAURA CAVATORTA; DIEGO CHOUHY; ELISA M. BOLATTI; ADRIANA A. GIRI

Encuentro; XLIII Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Virología.; 2023

Desde la identificación del SARS-CoV-2, se han intensificado los esfuerzos por desarrollar pruebas diagnósticas que permitan una detección temprana de la infección. Los test de diagnóstico en el punto de atención son los más utilizados para campañas de testeo masivo debido a su rapidez, sencillez, fácil estandarización, buena correlación con la qRT-PCR y elevado valor predictivo positivo. La mayoría de estos test disponibles en el mercado utilizan anticuerpos monoclonales (AcM). Los aptámeros son moléculas de ADN o ARN de una sola hebra capaces de unirse con alta afinidad y especificidad a una amplia gama de moléculas, además su producción requiere una infraestructura sencilla y económica en comparación con los AcM.Objetivo: Evaluar la capacidad de unión de cinco aptámeros reportados en bibliografía para ser utilizados como sensores moleculares en el desarrollo de un test rápido de detección de antígenos de COVID-19.Metodología: La expresión de la proteína N se realizó a partir de plásmidos sintéticos conteniendo las secuencias de la variante Ómicron de SARS-COV-2 con condiciones de inducción optimizadas: 0,5 mM de IPTG a 37°C por 4hs. La intensidad de fluorescencia del complejo Aptámero-Proteína se midió con citometría de flujo, con estos valores se calculó la constante de disociación (Kd) y se realizaron pruebas de competencia. Se evaluaron concentraciones crecientes de los aptámeros hasta alcanzar la saturación para definir las relaciones óptimas de Aptámero-nanopartículas de oro (Apt/AuNP), que servirá como revelado en las pruebas, y de Estreptavidina-Aptámero (StV/Apt) para su inmovilización en la línea de test.Resultados: Se seleccionaron 3 aptámeros que presentaron mayor afinidad a la proteína N: A-48 (kd=76nM) A-61 (kd= 22,3nM) y A-15 (kd=20,8nM) y se corroboró, mediante los análisis de competencia, que se unen a regiones diferentes de la proteína N.El aptámero A-48 presentó la menor concentración de saturación para ser conjugado con AuNp (10 nM) y se seleccionó como conjugado Apt/AuNp para el sistema de revelado. Por otro lado, se evaluaron concentraciones crecientes de Stv (10 ng/μl, 100 ng/μl, 500 ng/μl) en membranas de nitrocelulosa, manteniendo la relación StV/Apt (A-15 o A-61) óptima, y se analizaron diversas concentraciones de proteína N (10 μg/ml , 5 μg/ml, 2 μg/ml) y GST (5 μg/ml) como control negativo. Estos ensayos permitieron determinar que nuestro sistema detecta hasta 5 μg/ml de proteína N en las condiciones: 500 ng/µl de Stv, 460 nM de A-61 o A-15 inmovilizada y una concentración final de A-48/AuNp de 1,3 nM.Conclusión: Los aptámeros seleccionados presentan afinidades adecuadas para su incorporación en un ensayo de cromatografía lateral para el diagnóstico de SARS-CoV-2. Las pruebas realizadas con nuestro sistema permitieron detectar la proteína N en membranas de nitrocelulosa. Se continúan optimizando las condiciones para mejorar el límite de detección del ensayo y avanzar en el desarrollo de tiras reactivas.Financiamiento: Secretaría de Ciencia, Tecnología e Innovación de la Provincia de Santa Fe (DTT 2021).