CARACTERIZACIÓN Y SELECCIÓN DE APTÁMEROS ESPECÍFICOS CONTRA LA PROTEÍNA DE LA NUCLEOCÁPSIDE (N) DE SARS-COV-2 PARA LA PUESTA A PUNTO DE UN PROTOTIPO DE TEST RÁPIDO.

JULIETA GARCIA REY; AGUSTINA CERRI; TOMAS BELLANDI; DIEGO CHOUHY; ELISA M. BOLATTI; ADRIANA A. GIRI

Jornada; XVII JORNADAS DE CIENCIAS, TECNOLOGÍAS E INNOVACIÓN DE LA UNR; 2023

Introducción: Desde la identificación del coronavirus pandémico SARS-CoV-2, se han realizado esfuerzos para desarrollar y producir pruebas diagnósticas que permitan detectar tempranamente la infección viral. La mayoría de estas pruebas disponibles en el mercado son de origen extranjero y utilizan anticuerpos monoclonales (AcM).Los aptámeros son moléculas de ADN o ARN de una sola hebra con una estructura tridimensional que les permite unirse con alta afinidad y especificidad a una amplia gama de moléculas, su producción requiere una infraestructura sencilla y económica.Objetivos: Expresar y purificar la proteína N recombinante de SARS-CoV-2 para evaluar la capacidad de unión de cinco aptámeros reportados en bibliografía que podrían ser utilizados como sensores moleculares para el desarrollo de un test rápido de detección de antígenos de COVID-19.Metodología: La expresión de la proteína N y su dominio de unión a ARN (RBD) se realizó a partir de plásmidos sintéticos conteniendo las secuencias de la variante Ómicron de SARS-COV-2 fusionadas a GST. Se optimizó un protocolo de expresión utilizando 12 condiciones de inducción (0.5 y 1 mM de IPTG incubados por 2 hs 4 hs y overnight, a dos temperaturas: 30°C y 37°C). La purificación de las proteínas se realizó con esferas de sefarosa de 34 μm de diámetro y la intensidad de fluorescencia del complejo Aptámero-Proteína se midió con citometría de flujo. Dichos valores se utilizaron para calcular la constante de disociación (Kd) como medida de afinidad de cada aptámero con el programa GraphPad Prism.9. Las pruebas de competencia se realizaron enfrentando las proteínas recombinantes con concentraciones crecientes de uno de los aptámeros y manteniendo al otro en concentración saturante.Resultados: Se logró optimizar la expresión de ambas proteínas bajo las condiciones: 0.5 mM de IPTG a 4 hs de incubación a 37°C, obteniéndose concentraciones aproximadas de 10 mg/ml. Teniendo en cuenta los resultados obtenidos (Figura 1), se seleccionaron 2 aptámeros que presentaron los menores valores de Kd: A-61 y A-15 y se corroboró, mediante los análisis de competencia, que los mismos se unían a regiones diferentes de la proteína N.Conclusiones: Los aptámeros seleccionados son candidatos adecuados para su aplicación en el desarrollo y puesta a punto de un test rápido de cromatografía lateral para el diagnóstico temprano de SARS-CoV-2.